大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、活血化瘀等功效, 現代研究表明, 大黃中含有蒽醌衍生物、苷類化合物、鞣質類、有機酸、揮發油、多糖等化學成分, 同時具有抗菌抗病毒、抗炎祛痰、瀉下、保護胃黏膜、保肝利膽、利尿改善腎功能、降血壓、降脂減肥、抗腫瘤等藥理作用[1]。
目前, 對大黃的活性組分離提取純化的研究較多, 如明膠沉淀法、聚酰胺法、葡聚糖凝膠法等, 但這些方法操作過程復雜, 處理能力有限、成本高。近年來, 大孔吸附樹脂技術由于操作簡單、成本低等特點, 在中藥的提取、分離純化方面得到了廣泛的應用, 不斷的受到研究學者的重點關注。本實驗通過研究D101樹脂對大黃蒽醌類組分的吸附性能和純化工藝, 而獲得較高純度的組分, 從而為大黃蒽醌類組分的分離純化提供參考。
1 儀器、試劑與試藥
1.1 儀器
Agilent 1220型高效液相色譜儀 (安捷倫科技有限公司) , KQ-250B型超聲波清洗機 (昆山市超聲儀器有限公司) , 電子天平 (北京科學儀器有限公司) , 旋轉蒸發器RE-2000A (鞏義市予華儀器有限公司) , SHZ-D循環水式真空泵 (鞏義市予華儀器有限公司) , 電熱恒溫水浴鍋 (北京市永光明醫療儀器廠) 。
1.2 試劑與試藥
大黃素對照品 (中國藥品生物制品檢定所) ;D101大孔吸附樹脂;磷酸、乙醇、甲醇、鹽酸、三氯甲烷 (均為分析純) , 色譜甲醇;水為娃哈哈純凈水;大黃藥材購自西安市萬壽路藥材市場, 經鑒定為蓼科植物唐古特大黃Pheum tanguticum Maxim.ex Balf.的干燥根及根莖。
2 方法與結果
2.1 溶液的制備
2.1.1 大黃提取液的制備
稱取50g大黃粗粉, 加入10倍量80%的乙醇回流提取3次, 每次0.5h, 濾過, 合并濾液, 濾液減壓回收乙醇, 最終得180m L濃縮液, 相當于0.278g/m L的生藥材。
2.1.2 供試品溶液的制備
精密量取大黃提取液0.6m L, 加入8%鹽酸液10m L, 超聲2min, 再加入三氯甲烷10m L加熱回流1h, 放冷, 置分液漏斗中, 分取三氯甲烷層, 酸液層用三氯甲烷萃取3次, 每次10m L, 合并三氯甲烷液, 減壓回收溶劑, 殘渣加甲醇溶解定容至10m L容量瓶中, 即得[2]。
2.1.3 對照品溶液的制備
精密稱取0.001g大黃素, 用甲醇溶解后定容至10m L, 制成100ug/m L的大黃素對照品溶液。
2.2 含量測定方法[3]
2.2.1 色譜條件色譜柱:
Ultis IlTMXB-C18 (10×250mm, 5um) ;流動相:甲醇-0.1%磷酸水溶液 (80:20) ;檢測波長:254nm;流速:1m L/min;柱溫:室溫。在此條件下, 大黃素的分離良好。
2.2.2 標準曲線的制備及線性范圍的考察
分別精密吸取混合對照品溶液4.0u L、8.0u L、10.0u L、12.0u L、16.0u L、20u L, 按“2.2.1”項下色譜條件注入液相色譜儀中, 記錄色譜峰面積, 以進樣量X (ug) 為橫坐標, 相應的峰面積A為縱坐標, 繪制標準曲線, 結果如下:
得標準曲線A=507.24X-0.4699, R=0.9998 (n=6) , 表明大黃素在0.2ug-2.0ug范圍內, 線性關系良好。
2.3 大黃總蒽醌的分離與純化工藝
2.3.1 大孔吸附樹脂的預處理用適量蒸餾水漂洗, 再用
95%乙醇浸泡24小時, 然后用蒸餾水將樹脂沖洗至無醇味, 用2倍于樹脂體積的5%鹽酸浸泡2小時, 用蒸餾水沖洗至中性;再用2倍樹脂體積的5%氫氧化鈉浸泡2小時后用水洗至中性, 備用。
2.3.1大孔吸附樹脂的預處理用適量蒸餾水漂洗, 再用95%乙醇浸泡24小時, 然后用蒸餾水將樹脂沖洗至無醇味, 用2倍于樹脂體積的5%鹽酸浸泡2小時, 用蒸餾水沖洗至中性;再用2倍樹脂體積的5%氫氧化鈉浸泡2小時后用水洗至中性, 備用。
2.3.2測定靜態的吸附量[4,5,6]取5mL預處理過的D101樹脂, 置100m L具塞錐形瓶中, 量取10m L大黃提取液, 加入錐形瓶中, 每間隔30 min振蕩3 min (6次) , 放置過夜, 過濾, 吸取濾液少量, 對濾液和上樣液進行HPLC測定大黃素含量, 計算吸附量為0.4048mg/m L吸附率為80.31%。
2.3.3測定動態的吸附量[4,5,6]取5m L預處理過的D101樹脂, 濕法裝柱 (20cm×1.5cm) , 量取10m L大黃提取液上柱, 流速1m L/min, 收集流出液, 用HPLC法測流出液中大黃素的含量, 計算吸附量為0.3816mg/mL吸附率為72.26%。
2.3.4上樣液濃度對吸附量的影響[4,5,6]取4份5mL預處理過的D101樹脂分別裝柱 (20cm×1.5cm) , 分別加入含生藥量為0.1315、0.0658、0.044、0.0329g/m L大黃提取液各20m L, 調節流速為lm L/min, 分別收集流出液, 用HPLC法測流出液大黃素有含量, 計算吸附量和吸附率。結果見表2。
結果表明, 在大黃提取液濃度較低時, 樹脂的吸附能力隨著提取液濃度的降低而降低。當提取液濃度為0.0658g/m L時, 吸附率最高, 所以選擇此濃度。
2.3.5泄露曲線的考察[4,5,6]取20mL預處理過的D101樹脂吸附裝柱 (20cm×1.5cm) , 以濃度為0.0658mg/m L大黃溶液進行動態吸附, 分段收集流出液, 每份15m L, 共收集15份, 取樣測定流出液中大黃素的含量。從第5份大黃素開始明顯泄露, 所以確定大黃提取液最大上柱體積為60mL, 即3倍的樹脂體積。
2.3.6洗脫劑的選擇[7]取3份20mL預處理過的D101樹脂分別裝柱, 按上述所確定的吸附條件上樣, 上樣結束后, 分別用100m L50%、70%、90%的乙醇洗脫樹脂柱, 收集洗脫液, 取樣測定流出液中大黃素的含量, 計算洗脫率;另外將洗脫液回收乙醇, 干燥, 稱定重量, 計算出膏率。
結果表明, 在一定范圍內, 洗脫劑的濃度越高, 對大黃素的洗脫能力越好, 出膏率也越大, 綜合各因素, 選用70%的乙醇為洗脫劑。
2.3.7洗脫曲線的考察[8]取20mL預處理過的D101樹脂裝柱, 調節流速為lm L/min, 量取60m L大黃提取液上樣, 上樣結束后, 用70%的乙醇洗脫, 分段收集流出液, 每份20m L, 共收集14份, 分別取樣測定流出液中大黃素的含量。前4份洗脫液中大黃素的含量經計算85%, 故確定洗脫體積的用量為4倍的樹脂體積。
2.4 驗證試驗
取3份20m L預處理過的D101樹脂分別裝柱, 調節流速為lm L/min, 分別加入60m L大黃提取液進行動態吸附, 然后用10倍量的水洗至近澄清, 最后各用80m L70%的乙醇以lm L/min的流速洗脫。計算D101樹脂對大黃蒽醌的吸附量、吸附率、解析率、浸膏收率。結果見表-3
從表-3中可以看出, D101樹脂分離純化大黃蒽醌類組分的方法穩定可行。
3 結語
D-101型大孔吸附樹脂是一類苯乙烯型非極性共聚體, 適用范圍比較廣, 對于不帶極性或弱極性的有機化合物, 吸附能力強。大黃蒽醌類組分極性較弱, 適宜選用此種分離、純化方法。本研究中采用D101大孔吸附樹脂對大黃蒽醌組分進行分離與純化, 吸附條件為:上樣液濃度為0.0658g/m L, 最大上樣液體積為3倍樹脂體積, 洗脫劑為4倍量樹脂體積的70%的乙醇。通過樹脂的富集純化的驗證性實驗, 測得總蒽醌浸膏收率為13.21%, 表明該樹脂純化大黃總蒽醌的工藝可行。
摘要：目的研究D101大孔樹脂對大黃蒽醌類組分的吸附性能和純化工藝。方法以大黃總蒽醌中的代表成分大黃素為考察指標, 采用HPLC法測定大黃素的含量, 考察D101大孔樹脂對大黃蒽醌類組分的純化工藝及參數。結果D101大孔吸附樹脂對大黃蒽醌的適宜交換吸附條件為:上樣液濃度為0.0658g/m L, 上樣液的最大量為3倍樹脂體積, 4倍量樹脂體積的70%乙醇為洗脫劑。結論 通過樹脂的富集純化, 測得總蒽醌浸膏收率為13.21%, 表明該樹脂純化大黃總蒽醌的工藝可行。
關鍵詞：D101大孔吸附樹脂,大黃,大黃素,HPLC,分離純化
參考文獻
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