免疫組化染色作為病理診斷中比較常見的診斷方法, 被廣泛作為臨床診斷的輔助性參考指標[1]。病理技師作為免疫組化操作和質量控制的執行者, 決定著免疫組化診斷的準確率。該研究中, 詳述免疫組化染色步驟, 并對每步操作進行經驗性分析, 現收集該院于2011年3月—2013年7月收治的肝臟穿刺石蠟切片64例患者的臨床資料進行分析, 報道如下。
1 資料與方法
1.1 一般材料
收集該院于2011年3月—2013年7月收治的肝臟穿刺石蠟切片64例。
1.2 方法
1.2.1 檢查方法
利用免疫組化法展開檢查, 所用試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司生產。
1.2.1 染色方法
(1) 石蠟切片脫蠟, 入蒸餾水, PBS沖洗, 沖洗3次, 沖洗3 min/次。 (2) 按照一抗相應要求, 利用抗原修復電磁爐專用高壓鍋對切片展開抗原修復。切片置于檸檬酸鹽緩沖液中, 沸騰2 min, 離火。 (3) 在切片中進行3%過氧化氫滴加并在孵育盒中靜置15 min左右, 對內源性過氧化物酶進行活性去除, 利用PBS進行3次沖洗, 沖洗3 min/次。 (4) 將適量山羊血清工作液滴加至切片中并展開封閉處理, 將之放于孵育盒進行15 min室溫下靜置, 將血清去掉, 不進行沖洗, 將一抗工作液滴入其中, 在37℃溫度進行1 h孵育, 或者4℃過夜。 (5) PBS沖洗, 沖洗3次, 沖洗3 min/次。 (6) 切片滴加生物素化二抗工作液, 置于孵育盒內, 室溫放置約15 min。 (7) PBS沖洗, 沖洗3次, 沖洗3 min/次。 (8) 在已用辣根過氧化物酶進行標記的鏈霉卵白素工作滴入切片, 并將之放于孵育盒中, 于室溫中進行15 min靜置。 (9) PBS沖洗, 沖洗3次, 沖洗3 min/次。 (10) 取DAB顯色液向切片中滴加并進行5 min顯色。 (11) 用自來水對切片進行沖洗后利用蘇木素進行復染, 之后進行脫水與透明處理, 利用中性樹膠進行封固。 (12) 利用光鏡展開觀察, 當切片細胞核為黃色顆粒時記為陽性。
2 免疫組化染色過程質量控制
2.1 組織固定過程質量控制
利用10%中心福爾馬林固定液對活檢組織展開有效固定, 避免蛋白彌散或蛋白降解。若固定過度會導致蛋白空間結構交聯過度, 當完成抗原修復之后, 通常也難以實現陽性結果, 或會導致中心陽性、四周陰性的結果。
2.2 控制烤片時間
在切片組織中選擇病灶核心區域組織, 將恒溫箱溫度設為58~60℃, 對核心區域組織進行2 h烤片, 或將之置于恒溫箱中, 設定溫度為58~60℃過夜, 禁止高溫烤片, 避免干燥條件下, 加熱會加速組織中抗原氧化, 破壞原有抗原結構。
2.3 控制抗原修復時間
熱導抗原修復可對免疫組化染色效果予以顯著改善?？乖迯褪址ㄖ饕懈邏哄佇迯图拔⒉t修復兩種。相較于微波抗原修復而言, 高壓加熱下行抗原修復在難以檢測的細胞核抗原及細胞中, 應給予最大程度重現。已有研究證明[2], 檸檬酸緩沖液高壓鍋抗原修復法對抗原的修復效果相對較好。
控制加熱時間, 對于切片質量是非常重要的。切片置入緩沖液至離火, 最好控制在5~8 min, 時間過長容易造成背景顏色過深。沸騰后2 min左右將鍋離火, 在自然狀況下切片逐漸冷卻。切片架以高溫塑料與不銹鋼等材質為宜, 不適合采用銅金屬作切片架, 以免在緩沖液p H值升高時導致掉片現象發生。在高壓鍋離火后, 在緩沖液冷卻之后將切片取出。
2.4 控制抗體滴加及孵育時間
檢查試劑有效期, 確保應用試劑處于有效期內, 并且在有效期內, 越早使用, 抗體的效價越高。還需要對試劑儲存狀態予以及時調整。在滴加一抗時, 應將孵育盒中封閉血清輕柔甩掉, 用濾紙將切片四周多余液體吸凈, 防止一抗稀釋后對正常效價造成影響[3]。在滴加辣根過氧化物酶鏈霉卵白素與二抗工作液時, 濾紙吸附玻片液體, 避免二抗工作液被稀釋, 減少假陰性的發生率。濕盒最好是4℃孵育, 過夜。
2.5 設置陽性對照
設置陽性對照, 避免假陽性。選取已知染色中度陽性以上的組織切片染色作為陽性對照, 提高組織切片的鑒定準確率。選擇已知染色陰性的組織切片染色作為陰性對照, 一般情況下, 陰性對照、陽性對照是同時選取, 確保具有確切臨床診斷及鑒別意義。
2.6 控制顯色試劑的配制及顯色時間
現配現用DAB顯色試劑, 控制顯色時間不超過5 mi, 若顯色時間過長, 容易造成背景染色過深。
2.7 控制對比染色時間
蘇木精復染時間只需幾秒, 盡可能選取淺淡蘇木精進行染色, 若蘇木精染色過深, 容易對已有陽性染色造成覆蓋, 或導致DAB顯色對比效果降低, 影響病理診斷結果或準確性。
3 討論
目前, 隨著各類抗體的出現, 人們逐漸意識到免疫組化在病理診斷及臨床治療中的重要作用, 當然, 免疫組化技術還存在某種程度的缺陷或不足, 需要病理技師充分認識到該不足之處, 通過努力, 盡可能避免該不足造成臨床誤診, 這需要病理技師不能提高自身理論素質和操作技能, 總結經驗, 分析原因, 嚴格執行規范化操作, 充分發揮免疫組化在病理診斷、鑒別診斷, 以及臨床治療中的重要參考價值[4]。
該研究中, 從組織固定、烤片時間、抗原選擇、時間控制、抗體滴加、孵育時間、陽性對照、顯色, 以及對比染色時間等方面, 對免疫組化染色及質量控制, 進行闡述和分析?？偠灾? 免疫組化制片較為繁瑣而細致, 病理技師需對免疫組化染色具體步驟予以準確把握并嚴格執行, 對制片、切片、閱片經驗加以不斷總結, 并做好免疫組化染色的質量控制, 這對于提高病理檢查質量, 具有非常重要的臨床意義。
摘要：目的 探討免疫組化染色步驟的質量控制及應用。方法 詳述免疫組化染色步驟, 并對每步操作進行經驗性分析。結果 從組織固定、烤片時間、抗原選擇、時間控制、抗體滴加、孵育時間、陽性對照、顯色, 以及對比染色時間等方面, 進行闡述和分析。結論 嚴格執行免疫組化染色步驟, 并在操作中總結經驗, 可以提高免疫組化診斷的準確率。
關鍵詞：免疫組化,染色,質量控制,體會
參考文獻
[1] 張衛琴.免疫組化技術在病理診斷中的應用[J].安徽醫藥, 2012, 16 (11) :1700.
[2] 郭秀芳.免疫組化染色質量控制在乳腺組織切片中的應用[J].河北醫藥, 2010, 32 (5) :596.
[3] 李麗華.病理免疫組化染色方法質量控制應注意的問題[J].局解手術學雜志, 2008, 17 (6) :434.
[4] 孫琪, 免疫組化染色質量控制的經驗和體會[J].寧夏醫科大學學報, 2010, 32 (1) :146.