論文題目：中國和尼日利亞棘球絳蟲流行株的遺傳變異研究
摘要：囊型棘球蚴?。╟ystic echinococcosis,CE）俗稱囊型包蟲病,是一種世界范圍內分布的人畜共患寄生蟲病,在亞洲、南美洲、歐洲和非洲（尤其是北非和東非）高度流行。因受包蟲感染的器官被廢棄和包蟲病患者的治療費用,CE造成了巨大的經濟損失。在人類和家畜,CE主要由細粒棘球絳蟲廣義種（Echinococcus granulosus sensu lato）引起?；诰€粒體（mitochondrial,mt）基因（組）的多態性研究是將一系列遺傳關系相近的蟲種（蟲株）歸為“基因型”。線粒體基因遺傳差異或多態性影響蟲種/基因型對宿主的偏好性及其感染性等。因此,了解某一特定地點寄生宿主的蟲種及其基因型的特性,對于理解和預測疫病的發展動態是非常有價值的,并且可以指導有效防控方案的制定。本研究調查了中國西藏自治區（Tibet Autonomous Region,TAR）4個縣細粒棘球絳蟲廣義種的蟲種多樣性和遺傳變異特點,并首次對導致尼日利亞CE的細粒棘球絳蟲廣義種的蟲種/基因型進行了研究與分析。本項研究還篩選了用于棘球絳蟲蟲種鑒定的微衛星標記,這對進一步分析棘球絳蟲種內和種間遺傳變異規律有潛在應用價值。首先,研究者在中國西藏和尼日利亞的不同屠宰場從不同中間宿主采集了棘球蚴包囊樣品。此外,在尼日利亞的一些地區,采集了終末宿主的糞便樣本。利用線粒體基因cox1、nad1、nad2和nad5對包囊樣品進行了蟲種鑒定,其中對一些蟲種的mt全基因組進行了測定與分析。利用貝葉斯推理（MrBayes）程序和馬爾可夫鏈蒙特卡羅（MCMC）抽樣方法和MEGA-X軟件的最大似然法（maximum likelihood method）,建立了蟲種/基因型/單倍型之間的系統發育關系,并評估其后驗分布規律,同時,基于不同mt基因和完整的mt基因組數據集在PopART中構建中值連接網絡（median-joining networks）。研究分析結果表明,西藏自治區屠宰場的綿羊（n=54）和牦牛（n=31）共計85個包囊分離株樣品中83株被鑒定為細粒棘球絳蟲狹義種:G1型（n=77）,G3型（n=6）,另外2株為加拿大棘球絳蟲G6型。用nad1/nad5基因分析顯示,16個突變位點中有9個為簡約信息位點,導致15個單倍型,而nad5基因分析顯示,17個突變位點中有14個為簡約信息位點,共導致14個單倍型。細粒棘球絳蟲狹義種（E.granulosus sensu stricto）群體單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（π）分析顯示,nad1的Hd和π分別為0.650和0.00127,nad5的Hd和π分別為0.782和0.00306,總體呈陰性安全系數。較低的群體遺傳固定系數(FST)表明綿羊和牦牛分離株之間沒有遺傳差異。在尼日利亞,通過調查1592個中間宿主和58個終末宿主了解了CE的流行情況,并分析了32株棘球蚴分離株的遺傳多樣性和變異規律。通過BLAST算法和Bayesian系統發育分析mt基因核苷酸序列表明,32個分離株中有31個為加拿大棘球絳蟲（G6/G7）,與之前報道的歐洲、亞洲、北非和東非的G6/G7單倍型的序列一致性為99%～100%。通過對具有代表性的G6/G7樣品的mt全基因組測序,得到了全長為13,731 bp的共價封閉的環狀DNA分子,總長度比之前報道的G6和G7的mt基因組序列長10 bp以上。此外,基于串聯的12個蛋白編碼基因序列進行的中接鄰接網絡分析和最大似然法構建的系統發育樹均正確地將它們鑒定為G6基因型。另一方面,nad1、nad5、cox1基因序列的BLAST結果證實了剩余的1個分離株為G1基因型,與GenBank中其它G1序列的相似性為99%～100%?；趎ad5基因（680 bp）的中值連接網絡分析進一步區分了G1和G3基因型。對終末宿主犬糞DNA檢測結果表明,未發現陽性樣本。為了探討微衛星信息標記在蟲種遺傳多樣性和種內變異研究中的應用,作者從Sanger研究院數據庫中下載了細粒棘球絳蟲（G1）（v3）的完整基因組序列,使用Unipro-UGENE v1.29.0軟件中的串聯重復序列查找器選項進行了微衛星靶標的篩選。首先,在每個微衛星側翼區域設計引物,然后用熒光標記的正向引物進行PCR擴增,最后對PCR產物進行毛細管電泳。生成的片段大小和亮度用GeneMapper 4.1確定。在篩選出的6個微衛星中,有2個,即EgSca6Ⅱ（GATA）和EgSca7Ⅱ（GCATG）擴增正確,共擴增出6個和12個等位基因157-198bp和208-262bp,分別產生5個和19個基因型/圖譜。然而,微衛星EgSca6-II的多態性信息含量（PIC）在棘球絳蟲不同種/基因型之間極低,總體PIC值為0.679,EgSca7-II的PIC值在0.295～0.660之間,總體值PIC為0.811。同樣,在其它不同的基因型/蟲種中也發現了相似的特征。結果表明,篩選出的標記物并不適用于細粒棘球絳蟲種/基因型的鑒定。綜上所述,該項研究報道了中國西藏自治區細粒棘球絳蟲狹義種復合種群的數量在不斷擴大。中國其它地區的綿羊、山羊、牦牛和人類中都有感染加拿大棘球絳蟲（G6、G7、G8和G10）的報道。在西藏自治區,僅有G6基因型感染綿羊的報道。本研究中,作者首次從牦牛中檢測到G6基因型。因此,作者建議今后在開展流行病學調查和防控工作時,全面調查加拿大棘球絳蟲種群（G6、G7、G8和G10）在全國范圍內其它潛在中間宿主的感染情況和遺傳多樣性,以及它們是否也感染人類,以便對CE控制計劃做出相應調整。此外,雖然人們普遍認為G1基因型是造成全球CE負擔的主要原因,但在尼日利亞,G1基因型不是造成CE的主要原因,這與之前的報告一致,相反,加拿大棘球絳蟲G6型可能是引起非洲部分地區CE流行的主要病原。本研究首次揭示了尼日利亞棘球絳蟲種群的遺傳結構及其對尼日利亞CE控制的意義,并確定了G6基因型是該地區的主要流行株。此外,由于mt基因組的數據集相對于單個基因的遺傳信息顯示出更大的優勢,本研究提供了來自尼日利亞不同中間宿主的具有代表性的G6型加拿大棘球絳蟲的mt全基因組序列,這為未來的西非和全球棘球絳蟲的遺傳群體多樣性研究提供了重要依據。此外,雖然本研究和以前報道均證實G6基因型普遍存在于尼日利亞和西非地區,但是,本研究在尼日利亞發現也存在G1基因型,這提示G1這一人獸共患病的病原體種群在尼日利亞和該地區的宿主范圍和分布范圍可能比以前報道的更為廣泛,在今后的工作中有必要在尼日利亞和西非地區進一步深入開展棘球屬絳蟲遺傳多樣性的調查。
關鍵詞：西藏自治區;尼日利亞;囊性棘球蚴病;遺傳變異;微衛星
學科專業：預防獸醫學
摘要
abstract
Abbreviation
CHAPTER Ⅰ General Introduction and Review of Literature
1.1 A brief history of Echinococcus spp.
1.2 Biology and life cycle
1.3 Epidemiology,genetic diversity and population structure
1.4 Cystic echinococcosis in China
1.4.1 CE Prevalence in animals
1.4.2 CE Prevalence in humans
1.4.3 Risk factors
1.4.4 CE control efforts in China
1.5 Cystic echinococcosis in Nigeria
1.5.1 CE Prevalence in animals
1.5.2 CE Prevalence in humans
1.5.3 Risk factors affecting CE prevalence in Nigeria
1.5.4 Bottleneck of cystic echinococcosis research in Nigeria
1.5.5 Statement of problem
1.6 Rationale
Chapter Ⅱ Genetic Diversity of Echinococcus spp. in Tibet Autonomous Region,China
2.1 Introduction
2.2 Materials and methods
2.2.1 Study area
2.2.2 Sample collection and DNA extraction
2.2.3 DNA amplification and sequencing
2.2.4 Molecular and phylogenetic analysis
2.3 Results
2.3.1 Haplotype networks of Echinococcus granulosus(s.s.)
2.3.2 Echinococcus canadensis phylogeny and network analysis
2.4 Discussion
2.5 Conclusion
Chapter Ⅲ Genetic Diversity of Echinococcus spp.in Nigeria
3.1 Introduction
3.2 Materials andmethods
3.2.1 Study area
3.2.2 Parasite material
3.2.3 DNA extraction,amplification,and sequencing of isolates
3.2.4 Molecular analysis
3.2.5 Complete mitochondrial analysis confirmation of the G6 genotype
3.2.6 Sequence assembly and mitochondrial genome annotation
3.2.7 Phylogeny and network construction
3.3 Results
3.3.1 Haplotype network of Echinococcus canadensis(G6/G7)
3.3.2 Neutrality and diversity indices
3.3.3 Phylogenetic analysis
3.3.4 G6 genotype confirmation analysis
3.3.5 Echinococcus granulosus sensu stricto Genotype G1
3.4 Discussion
3.4.1 Complete mitochondrial genome
3.4.2 Echinococcus granulosus sensu stricto genotype G1
3.5 Conclusion
Chapter Ⅳ Development of Microsatellite DNA Markers for Investigating Genetic Variation among Echinococcus spp.
4.1 Introduction
4.2 Materials and methods
4.2.1 Microsatellite screening and selection
4.2.2 Primer design and Characterization of microsatellites
4.2.3 Panel of Echinococcus isolates used for this study
4.3 Results
4.4 Discussion
4.5 Study limitation
4.6 Conclusion
Chapter Ⅴ General Conclusion
References
Appendix
Acknowledgements
Author’s Resume