星形細胞瘤是最常見的中樞神經系統的腫瘤, 占膠質瘤的20%~50%, 平均復發時間為2年半[1]。目前認為腫瘤是一種多基因變化、多步驟發生的細胞周期性疾病[2], Cyclins蛋白是細胞周期調控的重要的癌基因蛋白, 我們應用流式細胞術的DNA/Cyclins雙參數分析法檢測星形細胞瘤復發前后的Cyclin A, Cyclin B1蛋白的表達, 以探討星形細胞瘤復發可能存在的細胞周期因子改變。
1 材料與方法
1.1 材料來源
選用我院2002年1月至2010年6月診斷為星形細胞腫瘤, 行開顱腫瘤切除術, 術后均全腦放療至今已復發, 并行第2次手術的18例患者標本為研究對象, 按WHO2000年中樞神經系統腫瘤分類標準分型分級, 第1次發病時星形細胞瘤Ⅰ~Ⅱ級11例, 星形細胞瘤Ⅲ~Ⅳ級7例, 均位于大腦半球, 第1次發病時未行放療或化療。
1.2 方法及步驟
獲取的臨床腫瘤組織塊, 包括正常腦組織 (3例) 、復發前后星形細胞腫瘤組織 (18例) , 用生理鹽水洗掉組織塊表面血污, 用手術刀剁碎, 200目鋼網過濾;, 細胞均以80%冰乙醇固定, -80℃保存。固定細胞與鼠抗人Cyclins (A、B1) 單克隆抗體孵育過夜, 孵育后細胞與標有FITC的二抗孵育30min, 再加入PI和Rnase避光處理20min, 用流式細胞儀 (Becton Dickson, 美國) 檢測。陰性對照采用不加一抗的Cyclins設立空白對照其余處理步驟同上 (抗體均購自美國Pharmigen公司) 。應用Mod LTFit2.0軟件和CELLQuest軟件 (Becton Dickson, 美國) 進行Cyclin A、Cyclin B1表達含量和時相的檢測和分析。
1.3 結果判定
Cyclins蛋白表達的定量分析方法:按照Morkve等[3]提出的分析方法, 以熒光指數 (Fluorescencelndex, 簡稱FI) 表示Cyclins蛋白的相對含量:FI (熒光指數) = (腦腫瘤樣品Cyclins蛋白平均熒光強度-對照組平均熒光強度) /正常腦組織Cyclins蛋白平均熒光強度。如FI值>1.0, 為Cyclins蛋白表達陽性, FI<1.0為陰性。
1.4 統計學處理
數據差異顯著性用χ2檢驗。
2 結果
本實驗中, 正常的腦組織中Cyclins的表達含量和時相均正常, 在星形細胞瘤中Cyclin A、Cyclin B1, 出現不同程度的異常表達, 包括過度表達及非時相表達, 過度表達指Cyclins表達的含量高于正常對照組, 非時相性表達則是指正常表達于G2期的Cyclins異常地出現在S、G1期中, 本實驗共檢測18對星形細胞瘤復發前后標本, Cyclin A在原發星形細胞瘤中的異常表達有7例, 占38.8%, 其中2例有非時相表達, 在復發星形細胞瘤中的異常表達有15例, 占83.3%, 其中8例有非時相表達, Cyclin A陽性率在星形細胞瘤復發前后有顯著性差異 (P<0.01) ;Cyclin B1在原發星形細胞瘤中的異常表達有6例, 占33.3%, 其中3例有非時相表達, 在復發星形細胞瘤中的異常表達有14例, 占77.7%, 其中7例有非時相表達Cyclin B1陽性率在星形細胞瘤復發前后有顯著性差異 (P<0.01) ;另外實驗中我們還發現復發星形細胞瘤中有較多的異倍體細胞。
3 討論
腫瘤最基本的特征是細胞的失控性生長, 因此可以說腫瘤的發生發展與細胞周期的破壞密切相關。而細胞周期調控機制的核心是Cylins的時相性表達, 正是由于這種高度保守的蛋白質所具備的時相性表達特點, 才使細胞周期蛋白依賴激酶 (CDK) 得以順序激活, 激活的CDKs作用于一系列底物使細胞周期在精確的調控下正常進行。細胞周期不同時相之間存在著關鍵的調控點, 包括控制進入S朗的調控點 (G1/S期調控點) 和控制進入M期的調控點 (G2/M期調控點) , 它是細胞唯一能從外界接受增殖信號或抑制信號的時期。G2期存在一個檢測點 (check point) , Cyclin A具有調節DNA合成和促進細胞進入分裂期的雙重作用。Cyclin B1在S期開始表達, 在G2M時達到峰值, 到有絲分裂中期向后期轉換時消失。Cyclin B1一直被認為在G2/M期對細胞分裂的調控起關鍵作用, 星形細胞瘤是顱內最常見的腫瘤, 其生長呈侵潤性, 邊界不清楚, 術后易復發, 且復發時惡性程度往往增加。大量研究顯示在乳腺癌、食管癌、肝細胞癌、結直腸癌、肺癌等中均發現有Cyclin A和Cyclin B1擴增和過度表達?，F在多數學者贊同星形細胞瘤存在cyclin A和Cyclin B1過表達和基因擴增, 且其程度與腫瘤分級和預后相關[4~6]。我們經FCM檢測的正常腦組織中Cyclin A和Cyclin B1表達含量和時相均正常, 而在原發星形細胞瘤中, Cyclin A有36.8%的陽性表達, 在復發發星形細胞瘤中有83.3%的陽性表達, 存在顯著性差異 (P<0.01) 。在原發星形細胞瘤中, Cyclin B1有27.8%的陽性表達, 在復發發星形細胞瘤中有50%的陽性表達, 存在顯著性差異 (P<0.01) 。提示Cyclin A和Cyclin B1在星形細胞瘤發生、發展過程中的重要分子事件之一, 可以作為星形細胞瘤預后復發的重要參考指標。
實驗中我們還發現在星形細胞瘤中cyclin A和Cyclin B1非時相性表達, 且復發后Cyclins蛋白表達的非時相性更加明顯, Hulsebos[7]等對膠質瘤的多種細胞周期調控因子進行了定量分析, 結果顯示將星形細胞瘤細胞用洛伐他汀同步化后細胞周期分析發現存在Cyclin B1的非時相性表達, 其意義尚不十分明了。我們認為Cyclin A和Cyclin B1蛋白表達的非時相性在腫瘤的惡性進展中起重要的作用。這種非時相性表達的Cyclin A和Cyclin B1蛋白可能有幾個原因引起: (1) Cyclins蛋白的降解過程受到破壞。 (2) 可能是某種Cyclins蛋白的抑制因子受到破壞。目前已證實星形細胞瘤中有P53, P21等抑制因子的異常改變。Stallings等[8]研究表明在病理級別增加的復發膠質瘤復發前后有TP53基因變異的不同。非時相性表達的Cylins蛋白會影響細胞周期的正常調控, 從而導致腫瘤的發生發展。Cyclin A和Cyclin B1非時相性表達在星形細胞瘤復發中的意義還不清楚, 實驗中我們還發現復發星形細胞瘤中有較多的異倍體細胞, 推測Cyclin A和Cyclin B1表達時相的延遲可以損害M期的進程, 導致多倍體, 異倍體細胞的形成[9]。
目前研究顯示Cyclin B1是一種腫瘤抗原, 我們在實驗中發現Cyclin B1的高表達往往伴有細胞凋亡, 其機制可能為腫瘤的免疫效應。同時我們認為可以利用Cyclin是一種較為保守的蛋白的特性, 研制腫瘤疫苗, 為腫瘤的治療提供一種新的方法。
本研究通過Cyclin A和Cyclin B1在復發星形細胞瘤中的表達, 證實了Cyclin A和Cyclin B1蛋白與星形細胞瘤的惡性進程和復發密切相關, 同時Cyclin A和Cyclin B1蛋白可作為判斷腫瘤復發有意義的預后指標, 深入研究不僅有助于揭示星形細胞瘤的發生發展機制, 并可為腫瘤的防治提供一個新的視點。
摘要：目的 研究CyclinA, CyclinB1蛋白在星形細胞瘤復發前后中的表達水平及其對預后的作用。方法 應用流式細胞術的DNA/Cyclin雙參數分析法檢測星形細胞瘤復發前后的CyclinA, CyclinB1蛋白的表達。結果 CyclinA在原發星形細胞瘤中的異常表達有7例, 占38.8%, 在復發星形細胞瘤中的異常表達有15例, 占83.3%, 其差異有顯著意義 (P<0.01) ;CyclinB1在原發星形細胞瘤中的異常表達有6例, 占33.3%, 在復發星形細胞瘤中的異常表達有14例, 占77.7%, 其差異有顯著意義 (P<0.01) 。同時發現在星形細胞瘤復發前后有CyclinA, CyclinB1的非時相表達。結論 CyclinA與CyclinB1的表達水平與星形細胞瘤的惡性程度呈正相關, CyclinA, CyclinB1可以更好的評價星形細胞瘤患者的預后。
關鍵詞：CyclinA, CyclinB1,星形細胞瘤,復發,流式細胞術,非時相表達
參考文獻
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