引言
蘆丁是黃酮類化合物的典型代表, 廣泛存在于自然界, 在植物的根、莖、葉、花、果實、種子中都有存在。一些常用中藥 (如大棗、山楂、銀杏、枸杞、益母草、柴胡、夏枯草、蘆薈、絞股藍等) 都含有蘆丁。目前, 我國蘆丁生產主要以槐米為原料進行提取?；泵拙哂兄寡? 降壓, 抗炎, 保護心血管, 抗血小板凝集, 抗病毒, 抗癌防癌, 抑制腦梗塞, 抗肝損傷及抗輻射損傷等藥理作用[1,2]。其中, 防癌抗癌、保護心血管、護肝、抗輻射等作用都歸因于蘆丁的抗氧化作用。目前蘆丁已做成藥物并在臨床上應用的有:蘆丁的衍生物三羥乙基蕓香甙 (troxerutin) , 即維腦路通, 用于治療燒傷、關節炎及各種血管疾病;蕓香甙膠囊, 治療內、外痔患者, 療效顯著;中華薄荷王是以蘆丁作紫外光吸收劑的一種天然防曬劑等。蘆丁具有保護血管和心肌, 降低甘油三酯, 清除活性氧, 抗氧化等多種藥理作用[3,4]。國內外對蘆丁的清除自由基作用研究較多:蘆丁具有較強的清除DPPH[5], 羥自由基[6], 氧負離子[6]的能力。相對而言, 蘆丁清除自由基的機理的研究較少[7], 張紅雨等[8]推測黃酮類化合物 (以蕓香甙為例) 清除O2·-是通過以下反應 (1) 完成的:
到目前為止, 關于蘆丁清除自由基動力學方面的研究尚未見任何文獻報道。本實驗首次從物理化學的角度研究了蘆丁抗氧化反應級數和反應活化能, 為探索蘆丁的抗氧化機制提供了進一步的科學依據。
1 實驗材料
1.1 主要試劑
鄰苯三酚, 三羥甲基氨基甲烷 (Tris) , 冰乙酸, 無水乙醇, H2O2, Fe SO4·7H2O, HCl, 水楊酸, 硫代硫酸鈉, 碘化鉀, Na OH, 檸檬酸, 磷酸, 均為分析純, 成都市科龍化工試劑廠;甲醇, 色譜純, 天津市科密歐化學試劑有限公司;三蒸水 (溶劑均經純化充氮保存) 。
1.2 主要儀器
SBD50恒溫水浴鍋, 丹麥Heto-Holten公司;U-1800紫外分光光度計, 日本HITACH儀器公司;高效液相色譜儀, 日本島津公司SHIMADZU;檢測器, SPD-M20A。
2 實驗方法
2.1 蘆丁對超氧自由基O2·-的清除能力試驗
采用鄰苯三酚自氧化法[9]。在試管中加入50mmol/L的Tris-HCl緩沖液 (p H8.2) 2m L, 再加入1m L不同濃度 (0.01, 0.03, 0.05, 0.08, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5) mg/m L的蘆丁, 于25℃保溫20min, 取出后立即加入25℃預溫的3mmol/L的鄰苯三酚0.3m L, 總體積3.3m L, 迅速搖勻, 倒入1cm比色杯中, 在25℃恒溫條件下測定325nm處的比色值, 每隔0.5min測一次吸光值。以0.3m L, 10mmol/L的鹽酸代替鄰苯三酚作為待測溶液的本底吸收值。每一吸光值平行測3次, 取其平均值。對O2-的清除率可表示為:
清除率 (%) = (A0- (AX-AX0) ) /A0×100%
其中:A0為空白對照液的吸光度;
AX為加入待測溶液后的吸光度;
AX0為待測溶液的本底吸收值。
2.2 HPLC法測定蘆丁對O2·-的清除能力
2.2.1 色譜條件
Hypersil BDS C18, 5μm (4.6mm×200mm) 色譜柱, 以甲醇:水:冰乙酸 (40:59:1) 為流動相;檢測波長254nm;流速為1.0m L/min, 柱溫30±1.0℃。
2.2.2 樣品測定
分別向6只試管中加入1m L濃度為0.1mg/m L的蘆丁, 再加入3m L的50mmol/L的Tris-HCl緩沖液, 然后加入1m L濃度為60mmol/L的鄰苯三酚, 在15℃下分別水浴0.5min, 1min, 2min, 4min, 6min, 10min, 然后用滴管滴入一滴3mol/L的鹽酸 (約0.01m L) 終止反應, 然后用20u L微量進樣器進樣, 記錄色譜圖, 測定峰面積;方法同上另一組在25℃下終止反應。對照組有: (1) 50mmol/L的Tris-HCl緩沖液; (2) 60mmol/L的鄰苯三酚; (3) 1m L 60mmol/L的鄰苯三酚在3m L PH值為8.2的TrisHCl緩沖液反應完全; (4) 0.1mg/m L的蘆丁, 色譜圖見圖1。
2.3 蘆丁及其氧化產物的摩爾吸光系數確定
配制0.1mg/m L (1.64×10-4mol/L) 的蘆丁溶液, 在1厘米比色杯中, 于254nm條件下測定蘆丁的吸光度, 用于計算蘆丁的吸光度值。
根據反應方程式 (1) , 1 mol的蘆丁 (1) 反應后將變為1mol的氧化產物 (2) , 即當蘆丁反應一半時, 蘆丁氧化產物將生產相同的量。根據圖1的濃度, 可以計算出蘆丁和蘆丁氧化產物的濃度相同時, 他們在254nm下的吸光度比 (HPLC圖譜中相應峰面積比) ;最后, 根據蘆丁的吸光度系數, 即可推算出蘆丁氧化產物的吸光度系數。
3 實驗結果與討論
3.1 蘆丁超氧自由基 (O2·-) 清除能力測定結果
蘆丁對超氧自由基 (O2·-) 的清除能力隨著濃度的增加而增加, 清除率與濃度關系曲線見圖2。
經回歸分析, 蘆丁的清除O2-·能力與濃度成對數關系, 回歸方程為:
濃度范圍0.01mg/m L~0.10mg/m L, R2=0.9864, IC50=0.0253mg/m L。
3.2 蘆丁及其氧化產物的吸光度系數
試驗測得1.64×10-4mol/L的蘆丁在254nm處的吸光度為2.268。
式中:A-吸收度;
L-液層厚度;
C-溶液的摩爾濃度。
根據 (2) 式, 可以計算蘆丁的摩爾吸光系數:
當蘆丁反應量達到50%時, 根據圖1可以計算出:
據此, 可以推算出蘆丁氧化產物 (2) 的摩爾吸光度系數為:ε1cm254nm=2.49×105。
3.3 反應級數和表觀速率常數
試驗測得15℃和25℃下, 反應體系中蘆丁濃度的變化如圖3。從圖中可以看到, 隨著時間的增加, 蘆丁的濃度單調下降。
反應 (Ⅰ) 中, 由于鄰苯三酚的濃度 (60mmol/L) 遠遠大于蘆丁的濃度 (0.164mmol/L) , O2·-由鄰苯三酚產生, 因而可以認為O2·-的濃度遠大于蘆丁的濃度, 此時可將O2·-的濃度視為常數, 所以該反應微分速率方程具有如下的簡單形式:
式中:VA為氧化反應的速度;
CA為蘆丁的濃度;
t為反應時間;
kA為反應速度常數;
n為反應級數。
對圖3進行二項式擬合, 可以得到:
根據 (6) 和 (7) 式, 對時間求導, 即可得到某一時間 (t) 時濃度對時間的導數d C/dt。以ln (-d C/dt) 對ln CA作圖, 可以得到圖4。
從圖4中可以看到, 他們有較好的線性關系, 而且二者的斜率基本相同。對直線進行擬合, 可以得到:
根據 (8) 和 (9) 式, 該直線的斜率即為反應級數, 曲線截距即為該反應表觀速度常數的對數。
對圖4進行回歸分析:-ln (-dc/dt) 與-lnc A成直線關系, 直線方程對應如下:
(10) 和 (11) 式斜率的平均值即為該反應級數的平均值:n=3.6101。
由直線截距計算得該反應的表觀速率常數為:
根據阿侖尼烏斯公式[10]:
取對數并變換方程式, 可以得到:
根據 (13) 式計算得到蘆丁抗氧自由基的反應活化能為:Ea=11.76k J/mol。
4 小結
應用紫外分光光度計和HPLC, 詳細研究了蘆丁體外清除氧自由基的反應動力學, 測定了其動力學常數:反應級數平均值n=3.6101, 在15℃和25℃條件下表觀速率常數分別為K15℃=5.53×1010mol-2.61·l2.61·min-1;K25℃=6.52×1010mol-2.61·l2.61·min-1, 表觀活化能Ea=11.76k J/mol, 初步確定了動力學模型
摘要：為確定蘆丁體外清除超氧自由基 (O2·-) 的動力學模型, 應用紫外可見吸收光譜和高效液相色譜, 采用鄰苯三酚自氧化法, 得出蘆丁氧化產物的吸光度系數ε254nm1cm=2.49×105, 反應級數平均值n=3.6101, 表觀活化能Ea=11.76kJ/mol, 初步確定了動力學常數。
關鍵詞：超氧自由基,紫外可見吸收光譜,HPLC,吸光度,反應級數,動力學
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