激光共聚焦掃描顯微鏡 (Laser confocal scanning microscope) 是20世紀80年代中期發展起來并得到廣泛應用的新技術[1], 它是激光、電子攝像和計算機圖像處理等現代高科技手段滲透, 并與傳統的光學顯微鏡結合產生的先進的細胞分子生物學分析儀器, 在生物及醫學領域的應用越來越廣泛, 已經成為生物醫學實驗研究的必備工具[2]。隨著激光共聚焦掃描顯微鏡技術的迅猛發展, 其應用已深入到工業、農業、通訊、軍事、科學研究等各個領域, 在食品領域也開始將其用于新產品的開發以及對已有產品的分析中。特別是近年來這種技術越來越受到食品科學家的重視, 在食品研究中顯示出其獨特的優勢。
1 激光共聚焦掃描顯微鏡的原理
在傳統光學顯微鏡基礎上, 激光共聚焦掃描顯微鏡用激光作為光源, 采用共扼聚焦原理和裝置, 并利用計算機對所觀察的對象進行數字圖像處理觀察、分析和輸出。其特點是可以對樣品進行斷層掃描和成像, 進行無損傷觀察和分析樣品的三維空間結構[3]。
在普通寬視野光學顯微鏡中, 整個標本全部都被水銀弧光燈或氙燈的光線照明, 圖像可以用肉眼直接觀察。同時, 來自焦點以外的其他區域的熒光對結構的干擾較大, 尤其是標本的厚度在2um以上時, 其影響更為明顯。
激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式, 采用激光束作光源, 激光束經照明針孔, 經由分光鏡反射至物鏡, 并聚焦于樣品上, 對標本焦平面上每一點進行掃描。組織樣品中如果有可被激發的熒光物質, 受到激發后發出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡, 通過探測針孔時先聚焦, 聚焦后的光被光電倍增管 (PMT) 探測收集, 并將信號輸送到計算機, 處理后在計算機顯示器上顯示圖像。在這個光路中, 只有在焦平面的光才能穿過探測針孔, 焦平面以外區域射來的光線在探測小孔平面是離焦的, 不能通過小孔。因此, 非觀察點的背景呈黑色, 反差增加, 成像清晰。由于照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的, 焦平面上的點同時聚焦于照明針孔與探測針孔, 焦平面以外的點不會在探測針孔處成像, 即共聚焦。以激光作光源并對樣品進行掃描, 在此過程中兩次聚焦, 故稱為激光共聚焦掃描顯微鏡 (圖1) 。
2 激光共聚焦掃描顯微鏡在食品中的應用
食品科學家在產品開發, 質量控制和基礎研究方面面臨眾多困難, LCSM使許多重要現象的研究成為可能, 如組分的可混性, 物理聚集和絮凝, 相分離以及添加劑和加工條件等對結構的影響等。該技術目前在國外的食品領域研究中已有大量文獻報道, 但在國內研究中較少。
2.1 研究食品原料或成分的微觀結構
利用激光共聚焦掃描顯微鏡進行食品原料或成分的結構研究, 對食品結構進行二維和三維的分層掃描, 從而獲得食品微觀結構的形態及二維和三維量化指標等。通過LCSM掃描觀察小麥、馬鈴薯、玉米等各種谷物淀粉顆粒, 可以得到不同產地或不同加工工藝的谷物淀粉的微觀結構, 從而研究各種淀粉的結構與其性質的關系;利用LCSM研究果蔬的細胞結構, 通過構造三維圖片觀察果蔬細胞的層次結構, 進而研究果蔬貯藏過程中的性質及變化。
2.2 研究食品的乳化性能及穩定性
食品的乳化性能決定了許多食品的結構、口感和穩定性, 因此了解食品體系中不同乳化劑的作用十分重要。LCSM打破了傳統的觀察界面上的兩相分布的方法, 由于LSCM可以同時觀察多個熒光通道, 利用不同的染色劑分別對幾種乳化劑染色, 通過改變酯類的濃度就可動態地觀察乳化劑的取代過程, 采用三維重建還能觀察到乳狀液的空間分布。
2.3 研究食品的凝膠結構
利用LCSM研究食品蛋白凝膠體系中的蛋白聚集物凝膠的形成, 分析其凝膠網絡三維結構的差異, 得出凝膠的微觀結構特性, 進一步分析食品的口感及功能特性差異。LCSM在研究各種凝膠的微觀結構方面有獨特的優勢, 尤其在各種動物蛋白凝膠體系中, LCSM能夠獲得具有高清晰微觀結構的圖片, 因此在國外被廣泛應用于肉制品蛋白或蛋白混合凝膠的結構及形成機理研究中。
2.4 研究食品加工過程的結構變化
激光共聚焦掃描顯微鏡技術可用于動態地觀察食品在加工過程中的結構狀態的變化及流變學特性等。利用LCSM可以檢測到面筋蛋白結構的變化過程, 并能觀察面團醒發過程中特定添加劑在面團中的位置。此外, LCSM還被用于研究流態食品凍結過程中蛋白質的結構變化。
3 展望
激光共聚焦掃描顯微鏡作為新興的儀器分析技術, 不但在生物醫學領域發揮了巨大的作用, 在食品領域也有著越來越廣泛的應用。LCSM不僅為食品科學家研究傳統的食品組織結構提供了方便, 而且使食品研究進入到微觀體系結構研究的新領域。食品科學家們利用LCSM的無損傷光學切片、三維重建、動態追蹤等特點能觀察到食品化學微觀的不均一性, 食品微生物的活性, 組織的生物構造及酶的活性。隨著LCSM技術的不斷完善, 它在食品領域中的作用也會越來越突出。
摘要：該文介紹了激光共聚焦掃描顯微鏡的特點及原理, 重點對其在食品領域中的發展和應用概況進行了綜述。該技術在研究食品的微觀組織結構及變化有獨特的優勢。
關鍵詞：激光共聚焦掃描顯微鏡,食品,微觀結構
參考文獻
[1] White J.G.et al.Confocal microscopycomes of age[J].Nature (London) , 1987, 328:183～184.
[2] Brakenhoff G.T.et al.Three dimen-sional imaging in fluorescence by con-focal scanning microscopy[J].Micros, 1989, 153 (2) :151～159.
[3] 王春梅, 黃曉峰, 楊家驥, 等.激光掃描共聚焦顯微鏡技術[M].西安:第四軍醫大學出版社, 2004.