香精在食品行業中被廣泛應用于嬰幼兒產品、糕點、飲品、糖果、巧克力中,它的特殊香味不僅彌補了食品口味的缺陷,而且降低了食品成本。香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、麥芽酚、乙基麥芽酚是食品中常用食品香味劑。至今,還沒有很多香蘭素對人體有害的相關報道。但是,據歐盟專家委員會報道,大劑量食用香蘭素可導致頭痛、惡心、嘔吐、呼吸困難,甚至損傷肝、腎;而麥芽酚具有弱的致突變活性和誘導細胞死亡的毒性[1]。并且,我國GB2760-2014規定了香料的禁用范圍及在嬰幼兒食品中香蘭素及乙基香蘭素的使用限量。所以,建立一種可靠、簡單、準確的香精檢測方法勢在必行。
目前,檢測香精的方法有氣相色譜法[2],氣相色譜質譜法[3],毛細管區帶電泳法[4],液相色譜法[5],液相色譜串聯質譜法[1]。這幾種方法存在檢測項目少、檢測成本高、檢測時間長的缺點。本實驗利用水超聲提取后,經HLB固相萃取柱凈化,通過高效液相法測定了奶粉中香蘭素,香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、麥芽酚、乙基麥芽酚含量,為香精檢測行業多提供一種檢測方法。
1.實驗部分
(1)儀器與設備
Agilent1290型超高壓液相色譜儀,配有DAD檢測器;
電子天平(精度0.0001g和精度0.01g)。
(2)試劑與材料
甲醇(色譜純);
磷酸二氫鈉(分析純);
磷酸(分析純);
固相萃取柱:MAX固相萃取柱(waters),HLB固相萃取柱(waters);
香蘭素對照品(純度98%)、甲基香蘭素對照品(純度98%)、乙基香蘭素對照品(純度98%)、麥芽酚對照品(純度98%)、乙基麥芽酚對照品(純度98%)。
(3)標準溶液的配制
①標準儲備液(10mg﹒mL-1)分別稱取香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、麥芽酚、乙基麥芽酚標準品0.1g(精確至0.0001g)置于10mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,于4℃冰箱中保存。
②標準使用液(1.0mg﹒mL-1),取標準儲備液1.0mL于10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。
(4)測定方法
①色譜條件
色譜柱AgilentSB-Aq柱(C18,150mm×2.1mm,粒徑1.8μm);
檢測器:Agilent二極管陣列檢測器;
柱溫:30℃;
流動相:甲醇+0.01mM磷酸二氫鈉(磷酸調PH=2.9);
流速:1.0mL﹒min-1;
檢測波長:278nm;
進樣量:10μL。
②標準曲線分別取各濃度的標準使用液,在上述色譜條件下測定,以標準使用液濃度為橫坐標,以相應的峰面積為縱坐標進行標準曲線的繪制。
(5)樣品前處理
稱取2.00g樣品于離心管中,加入40mL水,超聲提取30min,8000r/min離心5min,過定性濾紙,取20mL濾液,加20mL水,混勻,取20mL過HLB柱,10mL水淋洗一次,抽干,5mL 80%甲醇溶液洗脫,最后定容至5mL,過有機膜,待測。
2.結果與討論
(1)色譜柱的選擇
本實驗比較了色譜柱DIKMA-Inertsil®ODS-2C18(250mm×4.6mm,5μm)、AgilentZORBAXSB-AqC18(250mm×4.6mm,5μm)和AgilentZORBAXSB-AqC18(150mm×2.1mm,1.8μm)。前者對甲基香蘭素和乙基香蘭素完全沒有分開,粒徑為5μm的AqC18柱的靈敏度明顯比粒徑為1.8μm的色譜柱低,考慮到降低檢出限,最后選擇AgilentZORBAXSB-AqC18(150mm×2.1mm,1.8μm)色譜柱作為該實驗的分析柱。
(2)流動相的選擇
流動相有機相比較了甲醇和乙腈,乙腈不能將五種香精完全分開,最終選擇甲醇作為有機流動相。
(3)蛋白沉淀劑的選擇
作為蛋白沉淀劑有多種,酸、堿、重金屬、有機溶劑等?？紤]到強酸強堿需要調PH值,因此本實驗主要考察了重金屬和有機溶劑的比較,重金屬沉淀劑有CuSO4溶液+NaOH溶液、亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液,有機溶劑沉淀劑有乙醇溶液。通過回收率比較,乙醇溶液的回收率明顯高于其它兩種重金屬沉淀劑。但是,只用乙醇沉淀蛋白后進樣測試,雜峰比較多,對乙基麥芽酚的定量有影響,然后進一步采用固相萃取柱凈化。本實驗比較了陰離子交換柱MAX柱和既親水又親酯的HLB柱,通過多次實驗比較,HLB幾乎沒有吸附,MAX柱對甲基香蘭素沒有吸附。最后又對HLB柱進行分析,考慮到乙醇能完全把目標物洗脫下來,然后在不加乙醇的條件下對HLB柱進行進一步分析。結果經過初步實驗回收率很高。因此,在使用HLB固相萃取柱的情況下,不加蛋白沉淀劑,回收率比較高。
(4)洗脫液甲醇不同含量的比較
本實驗對甲醇含量分別為:35%、50%、65%、80%、100%進行比較。當甲醇含量超過50%時,回收率趨于平穩,但是,甲醇含量越多,雜峰干擾影響越大。因此最后選擇甲醇含量為80%作為洗脫溶劑。
(5)洗脫體積的比較
本實驗考察了1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL不同體積的洗脫溶劑,當洗脫體積大于3mL時,回收率趨于穩定。同時考慮到洗脫完全,因此選擇洗脫體積為5mL。
(6)標準曲線、線性關系、檢出限和定量限
標準曲線的繪制:臨用前吸取一定體積的標準儲備液用甲醇逐級稀釋,使其最終濃度為0.2μg﹒mL-1、0.3μg﹒mL-1、0.5μg﹒mL-1、1.0μg﹒mL-1、2.0μg﹒mL-1、4.0μg﹒mL-1、 8.0μg﹒mL-1、10.0μg﹒mL-1。分別取以上各濃度的標準使用液,在上述色譜條件下測定,以標準使用液濃度為橫坐標,以相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。根據S/N=3峰面積對應的化合物含量作為檢出限,檢出限為2.5mg﹒kg-1,S/N=10峰面積對應的化合物含量為定量限,定量限為7.5mg﹒kg-1。其標準曲線及相關系數見表1。
(7)精密度和回收率
本實驗分別在2倍定量限、4倍定量限和10倍定量限添加水平上對奶粉空白樣品進行精密度和回收率測試,回收率在83.1%～88.1%之間,精密度在2.8%～7.3%之間。其結果見表2。
3.結論
奶粉樣品用水超聲提取,經HLB柱凈化,80%的甲醇水溶液洗脫,最后用二極管陣列-UPLC檢測。該方法操作簡單,回收率高,同時檢測5種香精,可以作為一種日常檢測的檢測方法。
摘要：建立了同時測定奶粉中5種香精含量的高效液相色譜法。首先對樣品進行超聲提取,再經HLB固相萃取柱凈化。采用AgilentSB-Aq柱(C18,150mm×2.1mm,粒徑1.8μm)、流動相為甲醇+0.01mM磷酸二氫鈉(磷酸調PH=2.9)、流速為1.0mL﹒min-1和檢測波長為278nm的色譜條件進行檢測。5種香精在0.2～10μg﹒mL-1范圍內線性良好,檢出限和定量限分別為2.5mg﹒kg-1和7.5mg﹒kg-1,平均加標回收率在83.1%～88.1%之間,精密度在2.8%～7.3%之間。該方法操作簡便,回收率高,可以作為奶粉中5種香精檢驗的檢測方法。
關鍵詞：高效液相色譜法,奶粉,香精
參考文獻
[1] 楊華梅,杭莉.超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定食品中4種常用香精.色譜,2015,33(3):250-255.
[2] 劉玉萍.嬰幼兒乳制品中香蘭素的檢測方法研究.湖南文理學院學報(自然科學版),2011,23(2):51-54.
[3] 趙建國,姜金斗.氣相色譜質譜聯用測定嬰幼兒奶粉中香蘭素和乙基香蘭素.生命科學儀器,2013,11(10):40-44.
[4] 陳星,關瑾,等.毛細管區帶電泳法同時分離測定香蘭素和鄰位香蘭素異構體.色譜,2011,28(11):1111-1114.
[5] 孫榮華,馬玉婷,等.二極管陣列反相高效液相色譜法測定蜜餞中香蘭素含量.中國衛生檢驗雜志,2011,21(3):586-587.