論文題目：乳酸菌緩解高脂飼料誘導烏鱧脂肪肝的作用機制研究
摘要：魚類脂肪肝疾病是全世界水產養殖中最常見的營養性疾病,尤其在我國淡水養殖品種中高發,肝臟脂肪沉積是誘導脂肪肝發病的主要原因,乳酸菌作為典型益生菌,在水產領域中的研究證明其能夠調節機體免疫力,但乳酸菌緩解魚類脂肪肝的研究也相對較少,其降脂的分子機制也尚不明確。因此,本研究以烏鱧（Channa argus）作為試驗動物,采用干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantrun）和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）進行干預,通過體內試驗和體外試驗探究3株乳酸菌緩解C.argus脂肪肝的分子機制,為C.argus健康養殖提供科學依據,同時為乳酸菌在水產養殖業的應用開辟新思路。本研究內容共五部分,研究結果如下:（1）C.argus脂肪肝模型建立為探究C.argus脂肪肝形成的分子機制,在基礎飼料的基礎上設立脂肪含量為9%（Control）、16%（L16）和22%（L22）的高脂飼料,連續飼喂C.argus 90 d,于30 d、60d和90 d進行取樣,通過組織切片觀察,結果表明90 d后Control組肝臟切片細胞緊密且無空泡,L22組和L16組肝細胞存在大量脂滴,且L22組呈網狀結構,L22組血清和肝臟中TG和TC含量顯著升高,血清中抗氧化酶CAT、SOD和GSH-Px酶活水平顯著下降。進一步研究發現L22組肝臟NF-κB表達水平顯著高于L16組和Control組,且L22組細胞凋亡相關基因Bax、Cas3、Cas8和Cas9的表達水平也顯著高于L16組和Control組,L22組血清中GOT和GPT水平顯著高于L16組和L22組,證明脂肪水平為22%的飼料飼喂C.argus能夠成功誘發C.argus脂肪肝。（2）基于轉錄組技術探尋高脂飼料誘發C.argus脂肪肝的關鍵基因在C.argus脂肪肝模型建立的基礎上,通過轉錄組測序,分析高脂組與對照組差異基因,結果表明,高脂組與對照組間差異基因GO富集涉及到158個通路,KEGG富集高達312個條信號通路,其中主要機體免疫調節、應激調節和脂肪代謝相關。相對于對照組,高脂飼料能夠顯著上調機體炎癥因子和凋亡相關基因的表達,同時抑制C.argus肝臟PPARα、ACOX1和LPL等脂肪降解相關基因表達,同時抑制LXRα和SREBP-1c等膽固醇代謝相關基因的表達,因此推測這些是高脂飼料導致C.argus脂肪肝的關鍵基因。（3）三株乳酸菌對C.argus生長、免疫、抗氧化和腸道菌群的影響為探究L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus對C.argus生長、免疫、抗氧化功能和腸道菌群的影響,使用3株乳酸菌調整至1×10~9CFU/m L包被飼料,飼喂C.argus 56 d后取樣,檢測生長性能、飼料效率、抗氧化指標、免疫指標以及腸道菌群豐度。結果表明,飼料中添加L.casei和L.rhamnosus降低C.argus腸道Proteobacteria的相對豐度,改善腸道菌群結構。相對于Control組,飼料中添加L.rhamnosus能夠提高C.argus生長性能和飼料效率,而且L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus提高C.argus血清和組織中SOD、CAT和GSH-Px酶活水平,上調組織中SOD和GST基因的表達,激活宿主免疫系統,提高C.argus的抗氧化能力和免疫力,抵抗A.hydrophila感染,且L.rhamnosus保護效果高于其他2組,保護率高達50%,而L.casei和L.plantarum保護率分別為37.5%和40%。（4）三株乳酸菌對高脂飼料誘導C.argus脂肪肝的影響在C.argus脂肪肝模型的基礎上,用L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus對高脂飼料進行包被,連續飼喂90 d后,測定肝臟脂質水平、炎癥因子、抗氧化酶活以及腸道菌群。切片H＆E染色和油紅O染色能夠觀察到L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus能夠改善高脂飼料誘導的C.argus脂肪肝癥狀。L.casei和L.rhamnosus能夠改善腸道菌群結構,抑制Protenateria的相對豐度,且L.rhamnosus通過激活PPARα調控下游ACOX1和LPL基因表達,緩解C.argus脂肪肝癥狀;L.casei通過激活LXRα和LPL參與調節脂代謝,緩解C.argus肝臟脂肪沉積;L.plantarum對腸道菌群豐度并未產生顯著影響,與L.casei和L.rhamnosus不同,L.plantarum通過激活LXRα調控SREBP-1c基因表達,緩解C.argus脂肪肝癥狀。（5）基于PPARα/LXRα體外探究三株乳酸菌緩解高脂飼料誘導C.argus脂肪肝的機制采用油酸（OA）構建C.argus原代肝細胞脂肪沉積模型,結果表明OA濃度為2.5mmol/L是能夠顯著提高TG、LDL和FFA含量,同時抑制脂代謝關鍵基因PPARα和LXRα的表達,導致脂肪沉積現象。在此基礎上,采用GW6471和GSK2033分別抑制PPARα和LXRα探究L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus緩解脂肪沉積的分子機制。結果表明,L.rhamnosus通過激活PPARα上調,進而激活ACOX1和LPL的轉錄水平,抑制PPARα活性后,上述基因表達水平顯著下調,胞內TG水平顯著上升,而抑制LXRα活性時,胞內TG水平與L.rhamnosus和OA組無差異;L.plantarum通過激活LXRα表達,降低LDL和FFA含量,抑制PPARα活性后,上述基因表達水平無顯著變化,胞內TC和FFA水平與L.plantarum和OA組無差異,而抑制LXRα活性時,胞內脂質水平顯著升高;L.casei通過調節PPARα、LXRα和LPL的上調表達,抑制PPARα和LXRα均會導致胞內脂質水平升高。綜上所述,體內試驗證明L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus能夠有效緩解高脂飼料誘導的C.argus脂肪肝癥狀,其中L.rhamnosus的降脂效果略優于其余兩株。體外試驗進一步證明L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus緩解脂肪肝癥狀的分子機制不盡相同,本研究結果為C.argus脂肪肝的發病機制的研究提供科學參考,同時也為解決當前水產養殖經濟品種脂肪肝提供理論基礎。
關鍵詞：乳酸菌;烏鱧;脂肪肝;PPARα;LXRα
學科專業：動物營養與飼料科學
摘要
abstract
中英文縮略詞對照表
前言
第一篇 文章綜述
第一章 魚類脂肪肝疾病的研究現狀
1.1 誘發脂肪肝的因素
1.2 脂肪肝的鑒別
1.3 抗脂肪肝因子
第二章 脂代謝關鍵基因的研究
2.1 過氧化物酶體增殖劑激活受體α
2.2 肝X型受體
2.3 脂蛋白脂肪酶
2.4 解偶聯基因
第三章 降脂益生菌的相關研究
第四章 研究目的及意義及研究內容和技術路線
4.1 研究目的與意義
4.2 研究內容
4.3 技術路線
第二篇 研究內容
第一章 高脂飼料誘導烏鱧脂肪肝模型的建立
1.1 材料與方法
1.2 結果
1.3 討論
1.4 小結
第二章 基于轉錄組技術探尋高脂飼料誘發烏鱧脂肪肝的關鍵基因
2.1 材料與方法
2.2 結果
2.3 討論
2.4 小結
第三章 三株乳酸菌對烏鱧生長、免疫以及抗氧化的影響
3.1 材料與方法
3.2 結果
3.3 討論
3.4 小結
第四章 三株乳酸菌緩解烏鱧脂肪肝的研究
4.1 材料與方法
4.2 結果
4.3 討論
4.4 小結
第五章 基于PPARα/LXRα體外探究三株乳酸菌緩解烏鱧原代肝細胞脂肪沉積的機制
第一節 油酸誘導C.argus肝細胞脂肪沉積的模型建立
5.1.1 材料與方法
5.1.2 結果
5.1.3 討論
5.1.4 小結
第二節 分別抑制 PPARα和LXRα體外探究三株乳酸菌緩解C.argus肝細胞脂肪沉積的機制
5.2.1 材料與方法
5.2.2 結果
5.2.3 討論
5.2.4 小結
結論
創新點
參考文獻
致謝