第一篇：糞腸球菌屎腸球菌
屎腸球菌
開放分類：健康生活細菌
屎腸球菌屬腸球菌屬，是人及動物腸道中正常菌群的一部分，腸球菌為圓形或橢圓形、呈鏈狀排列的革蘭陽性球菌，無芽胞，無鞭毛，為需氧或兼性厭氧菌。 摘要
目錄 1簡介
2耐藥特征
3耐藥性分析
4溶血素形成過程
5生物學特性
6對抗生素耐藥性分析
7應用研究
8潛在危害性
屎腸球菌耐藥特征
了解糞腸球菌和屎腸球菌在臨床標本中的分布及對常用抗菌藥物的耐藥性，比較不同標本中兩種腸球菌的耐藥性，為臨床治療提供參考。方法 常規法進行菌種鑒定，紙片擴散法進行藥物敏感試驗。結果420株腸球菌屬，來源于尿液、膿液分泌物、痰液，分別占43%、20%、14%位居各類標本中的前3位，糞腸球菌對青霉素、氨芐西林和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率分別為23.0%、17.6%和21.2%，明顯低于屎腸球菌對這3種抗菌藥物的耐藥率(90.0%、87.0%和87.7%)，而屎腸球菌對氯霉素和四環素的耐藥率分別為7.9%和24.6%，明顯低于糞腸球菌對這兩種抗菌藥物的耐藥率(43.8%和74.4%)，兩種腸球菌中，未發現萬古霉素耐藥株;尿液標本中糞腸球菌對呋喃妥因的耐藥率明顯低于屎腸球菌。結論 臨床標本中，腸球菌屬在尿液中的分布最高;糞腸球菌和屎腸球菌的耐藥譜明顯不同，在治療時，應根據不同的菌種選擇用藥，由于腸球菌屬對萬古霉素的耐藥率極低，在重癥感染時，可選用萬古霉素進行治療。
屎腸球菌溶血素形成過程
屎腸球菌圖冊
其他毒力因子
1、聚集物質AS (aggregation substance)
聚集物質是腸球菌的表面蛋白。最初研究表明，它是細菌質粒得以進行接合傳遞的蛋白。以后發現該蛋白除了介導細菌細菌之間的接觸外，也促進細菌與宿主細胞的粘附而與許多感染性疾病相關。研究表明與健康人群來源的菌株相比，臨床來源的菌株聚集物質基因Asa1呈高流行。1998年Schlievert-PM等在研究腸球菌引起的心臟感染的小鼠模型時，發現給小鼠注射含有聚集物質AS及結合物質EBS (enterococcal binding substance, AS受體)的菌株AS+EBS+株，小鼠出現癥狀并死亡。給予AS-EBS-株則均存活。進一步在用導管插入術構造心內膜炎的小鼠模型中發現，AS+EBS+菌株產生的贅生物較大，脾腫大更嚴重，認為AS在心內膜炎中起重要作用。
AS聚集物質的致病機制主要是對真核細胞的黏附。聚集物質C端含有LPXTG細胞壁錨著基序結合細菌，N末端含有兩個Arg-Gly-Asp 基序即RGD，而相鄰的N末端區可以被巨噬細胞結合，也可被真核細胞表面受體整合素CD11b/CD18(CR3)識別 ，通過整合素的介導間接提高細菌的黏附能力。體外實驗觀察到AS有助于腸球菌黏附腸上皮細胞、腎小管細胞及心臟內皮細胞。聚集物質還有助于腸球菌粘連至細胞外基質蛋白如：纖維蛋白、纖維連接蛋白、血小板凝血酶敏感蛋白、玻璃粘連蛋白、膠原Ⅰ型等，這種黏附是導致宿主細胞感染的第一步。
2、表面蛋白esp (enterococcus surface protein)
esp基因最初是由shankar在臨床分離的糞腸球菌E.faecalis中發現的，帶有該基因的菌株引起多重感染，后來陸續在屎腸球菌E.faecium中也發現了esp基因。研究表明含有esp基因的臨床分離菌株普遍具有生物膜形成能力如： Esp有助于E.faecalis在膀胱中持續存在,從而提高感染能力。Esp還可促進細菌對無生命物質的黏附并形成生物膜，如體外試驗中esp蛋白可在聚苯乙烯或聚氯乙稀表面形成膜。生物膜的形成可以使細菌的感染更加持久，呈慢性趨勢[65-67]。因此，腸球菌在尿路感染中的分離率較高。
E.faecalis的Esp蛋白是一種由1873個氨基酸組成的細胞壁相關蛋白。esp蛋白與金黃色葡萄球菌的膜形成相關蛋白Bsp結構上具有相似性。其N末端的氨基酸序列(50-743aa)與數據庫的序列無相似性，中間核心區序列(744-1665aa)的球形結構同B型鏈球菌的Calpha及Rib蛋白結構相似，C末端重復序列(1666-1873aa)含有膜形成疏水區及一個較小變異的LPXTGX基序，大多數革蘭陽性菌的胞膜相關蛋白存在此基序。
3、心內膜炎抗原efaA
efaA是一種分泌到血清中結合胞壁的蛋白，是腸球菌的又一表面黏附素蛋白，和口腔鏈球菌的黏附素有顯著的同源性。腸球菌是引起感染性心內膜炎的第三大原因，約導致5-20%自身心內膜炎，6-7%人工心內膜炎病例。腸球菌通過efaA結合心臟組織基質，引起心內膜感染。有報道E.faecalis的efaA 在小鼠腹膜炎模型中，也有致病性。
4、膠原結合蛋白ace (accessory colonization factor)
膠原結合蛋白是腸球菌表面的黏附素，又稱粘附聚集因子，屬于MSCRAMM家族(microbial surface components recognizing adhesive matrix mole- cules)，可以介導腸球菌黏附膠原I型和膠原IV型及層粘連蛋白等，是腸球菌的毒力因子[70]。在不同類腸球菌中有不同的名稱，在糞腸球菌中為Ace，在屎腸球菌中稱Acm。Ace在糞腸球菌E.faecalis中檢出率比較低。屎腸球菌Acm與金黃色葡萄球菌膠原黏附素Cna總體有62%的同源性，也是潛在的致病因子。
5、明膠酶gelE(gelatinase)
據報道幾乎一半的臨床分離菌株中有明膠酶表達，而在健康個體中明膠酶分離率約為27%。明膠酶在E.faecalis和E.faecium臨床菌株中均可分離到。腸球菌感染的動物模型表明：明膠酶及其調節基因fsr(enterococcus faecalis regulator)具有致病作用，序列分析表明:腸球菌的明膠酶與銅綠假單胞菌的胰蛋白酶(33KDa)以及桿菌的中性蛋白酶相似。實驗表明：明膠酶可以水解明膠、膠原、酪蛋白、血紅蛋白和其它生物活性肽，引起細菌擴散，參與炎癥的進程。
6、胞外的超氧化物O2-
很多E.faecalis及一些E.faecium等菌株，可以產生超氧化物，而且其產量比一般的非致病菌株多。如Huyke-MM等人報告臨床分離的標本中有95%的E.faecalis，38.5%的E.faecium產生胞外O2-。氧自由基可以破壞細胞膜，使腸球菌通過薄弱的上皮屏障進入血液。超氧化物還可以引起紅細胞溶解，并可使組織損傷更嚴重。
7、透明質酸酶
透明質酸酶是細菌表面相關的酶，能促進細菌在結締組織的傳播。腸球菌也能分泌透明質酸酶。Rosan和Williams在研究致齒周圍疾病的微生物時發現腸球菌透明質酸酶和化膿性鏈球菌的透明質酸酶有60%的相似。透明質酸酶也可能是腸球菌的致病因子，在侵襲性疾病中可能起作用。
8、脂磷壁酸(lipoteichoic acid)
它是革蘭染色陽性菌細胞壁上普遍存在的由親水的多聚磷酸甘油骨架通過酯鍵與疏水的糖脂結合形成的兩性分子聚合體，在許多革蘭染色陽性菌中，它是炎癥因子的刺激物。 Ehrenfeld等報道純化的來源于E.faecalis的脂胞壁酸抑制由性信息素誘導的菌細胞的聚集。其致病作用可能與調節炎癥反應和促進質粒轉移有關。
9、性信息素(sex pheromone)
性信息素是E.faecalis分泌的一個小的線形肽段(7-8氨基酸)，誘導腸球菌的asa1等基因，表達聚集物質，促進菌株之間質粒的接合轉移，及粘附宿主細胞。同時性信息素還具有人白細胞趨化劑的作用，引起粒酶的釋放和呼吸爆發。所以，性信息素也是腸球菌的致病因子。腸球菌的AS基因，存在于不同質粒上，由不同的性信息素誘導產生相應的聚集物質。性信息素的編碼基因有cpd、ccf、cob、cad等。
10、磷脂酶
磷脂酶在其它細菌中是毒力因子，但作為腸球菌的毒力因子，目前缺少足夠的證據，只在E.faecalis有35%的分離率，在E.faecium中的分離率為4%。 上述致病因子中各毒力基因并不同時出現，研究還發現上述致病因子基因型和表型并不一致，雖然腸球菌致病相關因子的發現使人們對于腸球菌的致病性有著更加明確的認識，但其中的機制尚未徹底明了，并且有些因子的確認還不具備充分的證據，如磷脂酶、透明質酸酶、超氧化物等。因此需要進一步從分子水平進行研究，為臨床的治療提供理論支持。
屎腸球菌對抗生素耐藥性分析
屎腸球菌分析圖冊
腸球菌屬是醫院感染的主要條件致病菌之一，可引起人體各種器官的感染。隨著抗菌藥物的廣泛應用，腸球菌屬耐藥性有所增加，特別是耐高濃度氨基糖苷類抗生素及耐萬古霉素腸球菌的增多，腸球菌引起的醫院感染有明顯增多的趨勢。為了解腸球菌的臨床感染及其耐藥特性，對近年臨床分離的腸球菌及其體外藥敏情況進行了分析。 腸球菌可引起尿路感染、菌血癥、肺炎、腦膜炎、心內膜炎等多種感染癥。本實驗結果顯示，在近3年多時間中，共分離到383株腸球菌，主要為糞腸球菌和屎腸球菌占87%。菌種來源顯示，尿液占首位(50.9%)，其次為膿液分泌物(225%)，痰標本占第三位(18%)，以上3類標本共占91.4%。腸球菌所致感染最多見于尿路感染，多與尿路器械的操作、流置導管、尿路結構異常有關，為僅次于大腸埃希菌的第二位引起尿路感染的病原菌。創傷及肺部感染也較為常見，可能與創傷暴露部位的感染以及介入性的操作(呼吸機、插管)等容易并發腸球菌感染有關。提示應加強此類疾病的醫院內感染的預防和控制。
研究顯示，萬古霉素和力奈唑烷對3種腸球菌均保持較高的敏感性(耐藥率<10%)，腸球菌對四環素耐藥率為40%-55%之間，對青霉素的耐藥率>80%。糞腸球菌對呋喃妥因的耐藥率9.2%，對莫西沙星、左旋氧氟沙星耐藥率分別為36.2%、44%。屎腸球菌對呋喃妥因的耐藥率為48.8%，對莫西沙星和左旋氧氟沙星的耐藥率分別為82.7%、86.6%。高濃度慶大毒素和高濃度鏈霉素的耐藥率在不同菌種間差異較大，糞腸球菌分別為36.2%、33.8%，而屎腸球菌則為63%、58.2%，鶉雞腸球菌為39.4%、54.5%，這些耐高濃度慶大霉素和高濃度鏈霉素的菌株，是因為產生了氨基糖苷鈍化酶，當它們與作用于細胞壁的抗菌藥物聯用時不具協同作用，從而給臨床抗感染治療帶來困難。屎腸球菌與糞腸球菌及鶉雞腸球菌進行比較，屎腸球菌的耐藥率明顯偏高，提示屎腸球菌的耐藥機制可能與糞腸球菌及鶉雞腸球菌不同，因此，臨床實驗室應對腸球菌鑒定到種的水平，以便指導臨床合理使用抗生素。
耐力古霉素腸球菌(VRE)的出現給臨床治療帶來了困難，其耐藥機制主要為細胞壁肽聚糖前體末端發生改變，使萬古霉素不能與之結合而失去抗菌活性。VRE所致嚴重感染目前尚無滿意可靠的治療方法，應依據藥敏試驗結果和臨床情況選擇用藥，并宜聯合用藥。許多文獻報道，利奈唑胺在體外對糞腸球菌及屎腸球菌包括VRE均有較好的抑菌活性，并經美國FDA批準可用于治療耐萬古霉素屎腸球菌感染。 近年來，國內外報道耐萬古霉素的腸球菌呈逐漸增加的趨勢，這就提示臨床合理使用萬古霉素，以保持腸球菌對萬古霉素的高度敏感性。[3] 屎腸球菌潛在危害性
腸球菌感染是新生兒敗血癥的第3位病因，近幾年新生兒和兒童腸球菌敗血癥的發病率增加了6倍。據報道腸球菌是內源性和外源性醫院感染的第二大病原菌，檢出率僅次于大腸桿菌。有資料統計，在引起尿路感染的致病菌中，腸球菌感染居第2位;腹腔、盆腔感染，腸球菌居第3位;敗血癥，腸球菌居第3位，病死率12.6%～57%。
當抗生素大量使用或宿主免疫力低下時，宿主與腸球菌之間的共生狀態失衡，腸球菌離開正常寄居部位進入其他組織器官，它首先在宿主組織局部聚集達到閾值密度，然后在粘附素的作用下粘附于宿主細胞的胞外矩陣蛋白，分泌細胞溶解素、明膠酶等毒力因子侵襲破壞宿主組織細胞，并通過質粒接合轉移使致病性在腸球菌種間擴散，并耐受宿主的非特異性免疫應答，引起感染性疾病的發生發展。
同時，腸球菌還極易形成耐藥性，其耐藥性包括固有耐藥、獲得性耐藥及耐受性3種。由于其細胞壁堅厚，腸球菌對許多抗生素表現為固有耐藥。腸球菌的耐藥性在20世紀70年代表現為對氨基糖甙類耐藥, 如慶大霉素和鏈霉素，80 年代表現為耐β-內酰胺類及糖肽類，1986年首次發現耐萬古霉素腸球菌(VRE)。90 年代以后，由于抗菌藥物廣泛應用，加之侵入性治療以及過度使用氟喹諾酮類和口服頭孢菌素類藥物等因素，導致腸球菌耐藥菌所致感染菌株及病例不斷增加，已成為院內感染的主要病因。由于這類細菌所引起的耐藥菌感染治療難度大，加之腸球菌對抗生索的耐藥現象比較復雜，目前，在臨床分離的腸球菌中有許多是多重耐藥菌株。
美國醫院內監測系統表明由VRE導致的醫院感染1989年為0.3% ，1993 年為7.9%，在ICU內則增加至13%，至1997 年，超過15%的醫院內腸球菌感染為VRE。VRE耐藥譜廣、易造成感染和流行并且能將耐萬古霉素基因轉移給其它革蘭氏陽性菌，如金黃色葡萄球菌等。同時腸球菌屬在干燥的物體表面可存活數日至數周，無疑可以從被污染的手和衣物表面進行攜帶傳播。腸球菌屬具備毒力和流行性，本身又可產生介導炎癥反應的能力，以及它的耐藥性和播散性(包括耐藥因子的播散)，都對臨床患者有潛在的危害，加重病情的進展。
另外，美國研究人員在《醫學微生物學雜志》上發表文章指出，糞腸球菌能產生有害化學物質，破壞DNA，進而引起促發直腸癌的基因活動。他們在實驗室中仔細研究了直腸細胞對糞腸球菌的反應。結果發現在發酵狀態下，糞腸球菌會生成一種叫“超氧化物”的氧分子，這種氧分子會破壞周圍細胞的DNA，但糞腸球菌的影響遠不止于此。這種超氧化物會給被稱為巨噬細胞的免疫細胞發出強烈信號，改變一些腸道寄生細胞的生長、分裂方式，甚至還會增強致癌基因的活動。研究證實，發酵狀態下，與人體重要生理過程相關的42種細胞基因都受到了糞腸球菌的影響。
因此，International Probiotics Association 和世界衛生組織(WHO)均建議：益生菌中不宜使用腸球菌!目前最新的益生菌產品如東海藥業生產的阿泰寧、寶樂安、爽舒寶等都不含有腸球菌，預計在不久的將來，我國政府也會出臺限制腸球菌用于微生態制劑的規定。 相關文獻
萬方數據期刊論文
屎腸球菌JT1701對人體腸系細菌的調控作用200135 ( 7 ) 屎腸球菌對仔豬生長性能、免疫和抗氧化功能的影響201123 ( 1 ) 201株腸球菌屬的臨床分布及耐藥分析200919 ( 7 ) 參考資料：
[1] 中國論文下載中心 HLAR糞腸球菌和屎腸球菌醫院感染分布特征及耐藥性分析 09-05-19 引用日期：2010-10-27
[2] 天津市思科福生物工程有限公司 屎腸球菌在豬飼料中的應用 引用日期：2010-10-27 [3] 中國期刊網 醫院感染中腸球菌對抗生素耐藥性分析 2010-2-1 引用日期：2010-10-27
第二篇：豬鏈球菌病預防工作方案
近期，四川省資陽、內江等地區發生由豬鏈球菌引起的人感染豬鏈球菌病疫情。豬鏈球菌病是一種人畜共患的急性傳染病，由C、D、E及L群鏈球菌引起的多種疾病的總稱，屬于二類動物疫病。鏈球菌分布廣泛，常存在于健康的哺乳動物和人體內，在動物機體抵抗力降低和外部環境發生變化的誘導下，會引起動物和人發病。豬鏈球菌可以通過傷口、消化道等途徑傳染給人。根據衛生部辦公廳《關于加強人感染豬鏈球菌病預防控制工作的緊急通知》(衛發電[]34號)、上海市衛生局《關于加強對人感染豬鏈球菌病防治工作的通知》(滬衛疾控[]49號)文件精神，為加強我區人感染豬鏈球菌病預防控制工作，保障人民群眾身體健康，特制訂本工作預案。
一、臨床癥狀
本病潛伏期短，平均常見潛伏期2～3天，最短可數小時，最長7天。病人感染后起病急，臨床表現為畏寒、發熱、頭痛、頭昏、全身不適、乏力、腹痛、腹瀉。外周血白細胞計數升高，中性粒細胞比例升高，嚴重患者發病初期白細胞可以降低或正常。
重癥病例迅速進展為中毒性休克綜合征，出現皮膚出血點、瘀點、瘀斑，血壓下降，脈壓差縮小?？杀憩F出凝血功能障礙、腎功能不全、肝功能不全、急性呼吸窘迫綜合征、軟組織壞死、筋膜炎等。少數病例在中毒性休克綜合征基礎上，出現化膿性腦膜炎表現。
部分病例表現為腦膜炎，惡心、嘔吐(可能為噴射性嘔吐)，重者可出現昏迷。腦膜刺激征陽性，腦脊液呈化膿性改變。皮膚沒有出血點、淤點、淤斑，無休克表現。
二、疫情監測
(一)信息收集
區疾控中心要加強信息收集工作，及時了解國內外人感染豬鏈球菌病疫情動態，同時加強與農委、畜牧獸醫部門的信息溝通，了解家畜感染豬鏈球菌病疫情，為預警和決策提供依據。
(二)病例監測
各醫療機構的感染性疾病科、內科、兒科、急診科等相關科室在診療過程中發現畏寒、高熱、伴有頭痛、頭昏、全身不適、乏力、腹痛、腹瀉、昏迷等全身中毒癥狀患者，應按照《人-豬鏈球菌病診斷標準(參考標準)》做好甄別、診斷工作，應重點詢問病人發病前7天內是否有與病死豬(羊)接觸史，如宰殺、洗切、銷售等流行病學史。對有類似癥狀且屬牲畜屠宰作業或有病死性牲畜接觸史的不明原因疾病患者，立即向區疾控中心報告。
(三)肉類屠宰加工場、家畜養殖場人員監測
區無肉類屠宰加工場和大型家畜養殖場，依據《上海市肉類屠宰加工場人-豬鏈球菌感染癥狀監測工作方案》(附件1)，各鎮(街道)應對轄區內小型家畜養殖場開展調查，摸清情況，對養殖場的工作人員開展人感染豬鏈球菌病癥狀監測工作。
三、疫情報告
各醫療機構凡發現和診斷為人感染豬鏈球菌病確診病人和疑似病人，按傳染病網絡直報要求做好疫情網絡直報工作。
四、治療原則
各醫療機構發現疑似病人，應轉入區傳染病院(市五醫院)或市公共衛生中心隔離治療。該病發病急，進展快，重癥病例病情兇險，各醫療機構要組織專家力量加強對病人的救治，盡最大可能減少死亡。
臨床治療包括一般治療、病原治療、抗休克治療、DIC(彌漫性血管內凝血)治療等措施。
五、控制措施
區疾控中心接到疫情報告后，立即組織開展流行病學調查，并實施疫點控制各項措施，同時向區衛生局和市疾控中心報告;區衛生局接到報告后，立即向區政府和市衛生局報告，并及時向區農委通報。
區疾控中心應配合區農委、畜牧獸醫部門對病(死)家畜進行消毒、焚燒、深埋等無害化處理。對病例家庭及其畜圈、禽舍等區域和病例發病前接觸的病、死豬所在家庭及其畜圈、禽舍等疫點區域進行消毒處理。
六、預防措施
(一)開展有關人感染豬鏈球菌病預防知識宣傳教育
針對人感染豬鏈球菌病的特點和預防知識，廣泛開展人感染豬鏈球菌病預防知識宣傳教育，重點宣傳人感染豬鏈球菌病主要臨床表現和預防知識，以提高市民對人感染豬鏈球菌病的了解與認識和防病意識。
(二)做好人感染豬鏈球菌病防治工作的業務培訓
組織開展醫療機構醫務人員、疾病預防控制人員人感染豬鏈球菌病防治業務培訓，使醫生掌握人感染豬鏈球菌病診斷與鑒別診斷及治療原則、流行病學調查和疫點處理要求，以做到早發現、早診斷、早報告、早治療，減少死亡率，防止疫情擴散蔓延。
(三)做好疫點處理隊伍建立和物資儲備
區疾病預防控制中心建立相應的疫點處理隊伍，配備必需的消毒藥品等物資，依據上海市預防控制中心《人-豬鏈球菌病疫點消毒處理工作程序(試行)》(附件2)進行。
第三篇： 糞鏈球菌在飼料中的應用
糞鏈球菌是目前專用的微生物青貯接種劑主要菌種之一, 它經過系列工藝制成的微生物制劑直接投喂養殖動物后, 有利于改善腸道內微生態平衡, 防治動物腸道菌叢區系紊亂, 有分解蛋白質為水肽、合成B 族維生素等功效。它能促進養殖動物的免疫反應, 提高抗體水平, 增強巨嗜細胞的活性。糞鏈球菌在國外飼料行業中已普遍使用, 在國內生產與應用中尚處起步階段。 ( 一) 糞鏈球菌的生理特性
1、糞鏈球菌分泌的乳酸為L 型乳酸, 又稱為自然乳酸或生理乳酸, 可完全被動物吸收利用。乳酸桿菌分泌的乳酸L 型和D 型都有, 但D 型不能被動物吸收利用, 雙岐桿菌分泌的乳酸也是L 型乳酸。
在動物的腸道里, pH 值可顯著影響微生物的數量與類型, 大部分來自食物和唾液里的微生物在腸道的酸性環境中存活很少,僅剩下大約103/mL 細菌, 主要是糞鏈球菌和乳酸菌、耐酸和不耐酸的細菌在腸道中還會受到不同的抗生因子如酸、蠕動、抗體等的影響, 但主要是pH 影響最大。而糞鏈球菌可在腸內形成生物薄膜附著在腸道粘膜上, 可以在腸道內發育、生長、繁殖,繁殖時間很短,19分鐘分裂一次。
糞鏈球菌還可把部分蛋白質分解成酰胺和氨基酸, 把大部分的碳水化合物的無氮浸出物轉化為乳酸, 而且能使飼料里的纖維變軟,所以飼料的轉化吸收率就比較高.糞鏈球菌分解的這些特殊營養成分彌補了常規餌料的營養缺陷, 對各種養殖動物幼體起到了十分重要的營養強化和促生長作用。
2、糞鏈球菌產生的抗菌物質大多是肽或蛋白質,被稱為細菌素。糞鏈球菌可分泌兩類細菌素, 一類僅只是對相關的菌有抑制作用,抗菌譜較窄, 可阻礙病原微生物接觸腸粘膜細胞; 另一類具有廣譜抗菌活性, 它們對致病菌如: 沙門氏菌、致辭賀氏病和假單孢菌都有很好的抑制作用。所以, 長期在飼料中添加糞鏈球菌可以減少養殖動物腸炎等疾病的發生。
糞鏈球菌在生長和代謝過程中產生對養殖動物有益的營養物質,如乳酸、氨基酸、維生素、酶及抑菌物質。在飼料添加中, 既有防腐作用, 又增加飼料的風味, 促進養殖動物的食欲。
3、飼料中添加糞鏈球菌可減少養殖中有機物質排泄量,有較地減少水質污染。
在水產養殖水體中,添加了糞鏈球菌不僅有利于提高飼料的消化率,同時又相應降低了排泄物中的氨態氨的濃度,減少了排泄物的不消化物, 改善了飼料環境, 減少了污染。
糞鏈球菌除了具有一般微生物所產生的有關酶外, 它還有一些特色的酶系, 正因為有 了這些酶系, 才賦予它重要的生理功能。由于飼料中餅粕、麥麩等農副產品中的植酸磷含 量較高, 對鈣等礦物質元素利用造成影響, 而在糞鏈球菌的生理作用下通過催化、水解等 反應分泌出L- 乳酸, 它可以對鈣質合成L-乳酸鈣, 促進養殖動物對鈣質的吸收。
( 二) 在飼料添加劑的研究過程中, 糞鏈球菌添加劑是近年來發展起來的新生事物,在研究進展中還存在一些問題, 主要原因是:
1、菌種失活
菌種失活導致功效降低是目前應用微生物飼料添加劑的問題之一, 除微生物制劑生產中的因素外, 飼料加工中的高溫、機械、制粒等操作以及養殖動物的腸道環境、抗生素的使用等因素都與菌種失活有關。國外的一些研究機構已取得了很好的發展, 國內的一些公司和高?？蒲兄行囊苍谘芯? 也取得了初步成功。
2、菌種的選育
糞鏈球菌的菌種不同, 它對不同養殖動物和不同飼糧類型的作用效果也不同, 因此在發展微生物飼料添加劑中, 根據養殖對象、飼糧的特異性來選育菌種, 才能達到最佳的使用效果, 另外, 現有一些實驗結果表明, 在低水平的日糧中使用糞鏈球菌飼料添加劑的效果比在營養較為全面的全價配合日糧中使用效果更為顯著。因此, 選育在高日糧水平條件下應用的菌種, 也是菌種選育的方向之一。
3、質量監督的制定和管理
由于微生物飼料添加劑是近年來發展起來的, 關于產品的質量、貯存期限、監督管理 程序及規章尚未制定出來, 市場上的產品質量良莠不齊。微生物飼料添加劑不僅具有與抗生素飼料添加劑相似的有益作用, 而且無毒、無副作用、無殘留、無抗藥性, 同時也不污染環境, 所以, 微生物飼料添加劑必將逐步發展, 并取得廣泛的應用。
第四篇：基于核酸檢測方法金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測試劑注冊技術審查指導原則
附件3 基于核酸檢測方法的金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測試劑注冊技術審查 指導原則 本指導原則旨在指導注冊申請人對基于核酸檢測方法進行耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌鑒別檢測的體外診斷試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評注冊申報資料提供參考。
本指導原則是針對基于核酸檢測方法進行耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌鑒別檢測的體外診斷試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。
本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導性文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規強制執行，如有能夠滿足法規要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。
本指導原則是在現行法規、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規、標準的不斷完善和科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。
一、適用范圍 (一)臨床背景 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)為革蘭陽性球菌，是葡萄球菌屬的一種，分布廣泛，多種動物和人均有易感性，是臨床上常見的致病菌。隨著抗菌藥物的使用，逐漸出現耐藥型金黃色葡萄球菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)。MRSA具有多重耐藥性，不僅對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥，也對氨基糖苷類、大環內酯類、四環素類和喹諾酮類藥物都表現出不同程度的耐藥，其對不同抗菌藥物的耐藥率存在較大的地域差異，并有不同的變化趨勢。
MRSA分為醫療機構相關性MRSA(healthcare-associated MRSA，HA-MRSA)、社區相關性MRSA ( community-associated MRSA，CA-MRSA )和家畜相關性(Livestock- associated MRSA，LA-MRSA)。CA-MRSA 和HA-MRSA 、LA-MRSA在微生物學、細菌耐藥(如HA-MRSA相較于CA-MRSA表現出更多多重耐藥)及臨床特點方面(如感染部位)有較大差異，根據這些特點可以將兩者進行區分。但由于人員在醫院和社區間不斷流動，CA-MRSA 和HA-MRSA 的差異日漸縮小。MRSA的分型有多種方式，如SCCmec、spa基因分型、多位點序列分型(MLST)、基于脈沖場凝膠電泳(PFGE)的分型等。
MRSA的耐藥機制可能是由于MRSA受到外界刺激后本身固有耐藥基因被激活或是引入了外來的耐藥基因并激活。目前臨床分離的MRSA菌株對大多數β-內酰胺抗菌藥物耐藥(新型頭孢菌素類除外)，大部分耐藥是由mecA、mecC基因介導，但是小部分MRSA不攜帶mecA基因，存在其它耐藥機制。
目前SA的臨床檢測方法包括：分離培養后，經染色觀察、血漿凝固酶試驗、生化鑒定，質譜鑒定及聚合酶鏈反應(PCR)檢測耐熱核酸酶(nuc)基因、SA保守基因16S rRNA和SA多種毒素基因。
MRSA的檢測方法包括頭孢西丁紙片擴散法、苯唑西林微量肉湯/瓊脂稀釋法(MIC)、苯唑西林瓊脂篩選法、青霉素結合蛋白(PBP2a)乳膠凝集法、顯色培養基法、自動化藥敏檢測以及聚合酶鏈反應(PCR)檢測mecA等基因方法。
美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)推薦用于MRSA的檢測方法有：紙片擴散法、2%NaCl肉湯/瓊脂稀釋法和苯唑西林瓊脂篩選法，這些檢測方法均需要在33-35℃條件下孵育24小時。
目前臨床推薦選擇頭孢西丁篩查試驗進行MRSA的檢測，還可以選擇苯唑西林微量肉湯/瓊脂稀釋法(MIC)。
MRSA/SA的臨床檢測樣本類型包括但不限于鼻拭子、痰液、皮膚及軟組織感染樣本、血培養陽性并革蘭染色法陽性球菌的樣品等人體樣本和培養物。不同樣本類型可能適用于不同的臨床預期用途：如用于醫療機構對住院病人包括重癥監護病人、手術病人及長期護理病人等MRSA院內感染的預防和控制的監測，用于結合其他實驗室檢測如微生物培養等輔助診斷MRSA/SA的感染，用于臨床需進行培養檢測的患者MRSA/SA感染的輔助診斷等。
(二)本指導原則適用范圍 本指導原則適用于基于核酸檢測方法進行耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌鑒別檢測的體外診斷試劑。常見方法包括熒光聚合酶鏈反應(PCR)方法、基因芯片法等。本指導原則的相關內容基于熒光聚合酶鏈反應(PCR)方法對產品相關申報資料提出要求，其他方法的相關產品可依據方法學的具體特點參照執行。
二、注冊申報資料要求 (一)綜述資料 綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、有關產品主要研究結果的總結和評價以及其他內容，其中，與預期用途相關的臨床適應癥應重點描述申報產品所檢測的金黃色葡萄球菌鑒定基因的選擇依據、耐藥突變位點與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的相關性、基因選擇的依據及覆蓋的耐藥菌的情況、產品驗證覆蓋的耐藥菌株及其在我國的流行特征;
產品描述應明確申報產品所有可檢出的耐藥基因型(可包含不同分型方式下的分型，如SCCmec型、spa型以及PFGE分型)、尚未驗證的耐藥菌株型別;
同類產品在國內外批準上市的情況，應著重從所檢菌株覆蓋情況、檢測的最低檢出限及不同菌株和型別間的交叉反應等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。綜述資料的撰寫應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》(國家食品藥品監督管理總局令第5號)和《體外診斷試劑注冊申報資料要求及說明》(國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號)的相關要求。
(二)主要原材料研究資料 此類產品主要為PCR方法，主要原材料包括引物、探針、DNA聚合酶、dNTP、尿嘧啶糖基化酶(如有)、核酸分離/純化組分(如有)、試劑盒質控品及企業參考品等。應提供主要原材料的選擇與來源、制備及質量標準等的研究資料、質控品的確認試驗資料;
生產企業還應提供企業參考品的原材料選擇、來源、質量指標、參考品的制備及陰陽性的確認過程等。
1.引物和探針：包括申報產品檢測靶序列的引物和探針以及內對照的引物和探針。應詳述引物和探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應情況。針對檢測靶序列的引物和探針，建議設計兩套或多套引物、探針以供篩選，針對預期適用的型別進行檢出準確性和特異性(如交叉反應)的評價，可采用擴增靶序列與SA和MRSA基因組比對研究的方法，最終確認最佳組合，并提交篩選的研究數據。引物、探針的質量標準應至少包括序列準確性、純度檢查、濃度檢查及功能性實驗等。
2.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶，其質量標準如下：
2.1DNA聚合酶應包括DNA聚合酶活性、無核酸內切酶活性、熱啟動能力(如適用)、熱穩定性等。
2.2如申報產品中包含尿嘧啶DNA糖基化酶，應對其酶活性及熱穩定性等質量控制標準進行規定。
3.dNTP：質量標準應至少包括純度檢查及功能性實驗等。
4.核酸分離/純化組分(如有)的原理介紹、主要組成、主要原材料的質量控制標準及相關驗證資料。
5.試劑盒質控品 試劑盒的質控體系通過設置各種試劑盒質控品來實現，針對陽性質控品和陰性質控品，申請人應明確質控品的來源、質量標準、質控品陰陽性的確認方法及相關驗證資料。質控品應參與樣本處理和檢測的全過程，如核酸的平行提取等步驟。申報產品的質控體系應考慮以下幾個方面：
5.1陽性質控品中應含有包含試劑盒所檢靶序列的DNA，優先使用MRSA/SA分離滅活菌株，也可以采用工程菌株、克隆菌株等。企業應對質控品的檢測結果做出明確的范圍要求(如Ct值)。
5.2陰性質控品應不含試劑盒所檢靶序列的基因，陰性質控的基質應與實際樣本基質一致或接近，以對可能存在的交叉污染產生的假陽性結果進行質量控制。
5.3對照(內標)可以對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，申請人應對內對照(內標)的引物、探針設計和模板濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。對內對照的檢測結果亦應做出明確的范圍要求(如Ct值)。
6.企業參考品：應詳細說明有關企業參考品的原料選擇、制備過程、提供陰陽性確認等試驗資料。
企業參考品應充分考慮產品檢測靶物質的各種基因型別和耐藥菌株，考慮產品驗證的性能需求進行設置。具體要求如下：
6.1陽性參考品 陽性參考品應采用經鑒定確認的多個臨床流行分離菌株、含有菌株純化的基因組DNA等，包含申報產品聲稱的應檢出的MRSA/SA基因型。應覆蓋我國主要的流行耐藥菌株，可包含不同分型方式下的分型，如SCCmec型、spa型以及PFGE分型等。
6.2陰性參考品(特異性參考品) 陰性參考品應考慮檢測MRSA和SA的特異性分別進行評價的要求，應納入不在試劑盒檢測范圍內的其他葡萄球菌、革蘭陽性菌菌株和其他病原體樣品，特別是可能存在潛在競爭抑制的甲氧西林敏感凝固酶陰性葡萄球菌。
6.3檢測限參考品 檢測限參考品應分別針對MRSA和SA每個分析物靶基因和不同樣本類型設定檢測限附近連續稀釋的參考品，應使用處于對數增長期的菌進行制備，明確每個參考品的活菌數，以CFU/mL表示。應明確CFU的確定方法。
6.4精密度參考品 精密度參考品應使用菌株針對每個檢測目標物設定一組參考品，包括陰性、弱陽性(略高于臨界值，預期重復檢測95%陽性)、中等陽性(高于臨界值，預期檢測結果100%陽性)三個水平。
如產品適用于不同的樣本類型，建議針對不同樣本類型設定不同的參考品基質，應與實際樣本類型基質一致或相似，模擬基質應經證實與天然基質無顯著差異。
若主要原材料為企業自己生產，其生產工藝必須相對穩定，并提交主要原材料制備過程;
如主要原材料購自其他供應商，則需針對供應商的選擇提供評價數據，并提供供應商出具的質量標準、出廠檢定報告，以及申請人對該原材料進行的質量檢驗資料。
(三)主要生產工藝及反應體系的研究資料 1.介紹產品主要生產工藝，可以圖表方式表示，并說明主要生產工藝的確定依據。
2.反應原理介紹。
3.詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇和設置，提供相關的研究資料。
4.確定最佳反應體系的研究資料，包括樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應各階段溫度、時間、循環數等。
5.不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。
6.如申報產品包含核酸分離/純化試劑，應提交對核酸分離/純化過程進行選擇的研究資料。
(四)分析性能評估資料 申請人應提交產品研制階段對試劑盒進行的所有性能評價的研究資料，對于每項分析性能的評價都應包括具體研究目的、試驗方法、可接受標準、試驗數據、統計方法等詳細資料。有關分析性能驗證的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實驗地點、適用儀器、試劑規格、批號和臨床樣本來源等。
針對不同的樣本類型如鼻拭子、痰液、皮膚和軟組織感染拭子樣本、血培養分離樣本等，申請人應分別完成性能評估，包括陰陽性符合率、最低檢測限、精密度評價、干擾驗證等。
分析性能評價的試驗方法可以參考相關的國外或國內有關體外診斷試劑性能評估的指導原則進行。各項性能評價應符合以下要求。
1.核酸分離/純化性能(如適用) 在進行靶核酸檢測前，應有適當的核酸分離/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的核酸外，還應有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸分離/純化的組分，企業都應結合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸分離/純化試劑針對聲稱樣本類型的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證，提供詳細的驗證資料。
2.最低檢測限 申報產品最低檢出限的性能評估資料應包含最低檢出限的確定及驗證過程。
應使用臨床分離獲得的特征良好的MRSA/SA分離菌株進行最低檢測限研究。所選菌株建議包含來自不同地區的MRSA/SA，以涵蓋金黃色葡萄球菌的遺傳多樣性，應覆蓋不同分型方式下的不同分型，如SCCmec型、spa型、PFGE分型，涵蓋我國不同地區臨床常見型別。最低檢測限的確定研究試驗應使用上述選定的多種有代表性的MRSA/SA分離菌株進行連續稀釋，以CFU/mL為檢測單位，如引入DNA拷貝數作為單位，應確定兩者之間的換算關系。稀釋基質應根據產品聲稱的樣本類型分別配合相應的基質。如樣本類型為鼻拭子、痰液或皮膚及軟組織感染拭子，建議使用陰性鼻拭子或陰性皮膚及軟組織拭子洗液或模擬基質進行稀釋，如可使用含生理鹽水、粘蛋白及人類基因組DNA的基質作為鼻拭子、痰液樣本替代基質，使用含白細胞、紅細胞、血漿的基質作為皮膚及軟組織拭子樣本的替代基質;
如樣本類型為經血培養并確定含革蘭陽性球菌(GPC)的樣本，應使用含人血液和適配的血液培養基作為模擬基質，并應添加高濃度的常見感染菌?？蓪⒛M樣本稀釋液培養一段時間。無論使用何種模擬或替代基質，應進行基質比對性試驗證明替代基質與臨床實際樣本的等效性。
將各稀釋液重復檢測3-5次，預估檢測限范圍后制備至少20份檢測限濃度樣本，證實MRSA/SA檢出率達到95%的濃度作為最低檢測限。針對不同的血培養瓶或血培養系統，應分別驗證檢測限是否一致。
3.包容性 應通過實驗證實產品能夠檢出的金黃色葡萄球菌中存在的基因多態性的MRSA/SA。在實驗驗證菌株納入時考慮金黃色葡萄球菌的進化結構，常見克隆系和型別，并納入不同SCCmec型、spa型、PFGE類型的菌株。建議檢索近年國內相關文獻報道并收集各地區、不同菌株(社區和醫院內感染，鼻腔、皮膚和軟組織感染等)進行菌株驗證。被驗證細菌的濃度應接近檢測限水平，所有菌株應進行鑒定和濃度測定。并應在預期可能存在高濃度(高于106CFU/mL)的其他感染菌如甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)和耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌情況下進行試驗。
4.申請人應對申報產品精密度指標做出合理要求。精密度評價使用菌株配制的企業參考品或相應臨床樣本進行，且精密度評價試驗應包含核酸分離/純化步驟。針對本類產品的精密度評價主要包括以下要求。
4.1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除檢測試劑(包括核酸分離/純化組分)本身的影響外，還應對分析儀、操作者、地點、檢測批次等要素進行相關的驗證。
4.2設定合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。
4.3用于精密度評價的參考品或臨床樣本均應至少包含3個水平：陰性、弱陽性(略高于臨界值，預期重復檢測95%陽性)、中等陽性(高于臨界值，預期檢測結果100%陽性)，并根據產品特性設定適當的精密度要求，臨床樣本精密度評價中的每一次檢測均應從核酸提取開始。
5.分析特異性 5.1交叉反應 交叉反應的驗證應結合樣本來源進行，針對不同樣本類型考慮可能共生的潛在的交叉反應病原體。應使用高濃度交叉反應病原體(如高于106CFU/mL的細菌和酵母，高于105PFU/mL的病毒)進行交叉反應驗證，以明確是否存在交叉反應所致的假陽性。
針對鼻拭子、痰液樣本，應考慮在鼻中及呼吸道的致病菌和共生菌，如甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)、凝固酶陰性葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)，以及革蘭陰性桿菌、革蘭陰性球菌、奈瑟菌、莫拉菌、酵母菌、革蘭陽性桿菌、革蘭陽性球菌等臨床常見菌種，凝固酶陽性葡萄球菌代表菌株。
針對皮膚和軟組織感染樣本或檢測來自血培養測定為陽性微生物生長并經革蘭染色證實為革蘭陽性球菌的樣本，應納入更多微生物，包括皮膚菌群。對于血培瓶來源的樣本無必要進行病毒交叉反應驗證。
5.2微生物干擾 同樣采用上述潛在交叉反應微生物，評價潛在微生物干擾，即是否對MRSA/SA臨界水平樣本檢測產生干擾。建議采用存在于各標本類型的(鼻拭子、痰液、皮膚和軟組織感染、血培養樣本)和代表不同MRSA基因型的至少兩個MRSA菌株在臨界水平進行微生物干擾試驗。
5.3干擾物質 評價各樣本類型中可能存在的干擾物質是否對檢測造成干擾。建議采用存在于各標本類型的(鼻拭子、痰液、皮膚和軟組織感染、血培養樣本)和代表不同MRSA基因型的至少兩個MRSA菌株的臨界濃度對干擾物質(潛在最高濃度)進行驗證。鼻拭子樣本的干擾物質應考慮血液、鼻腔分泌物或黏液、鼻腔用藥。痰液樣本的干擾物應考慮如血液、粘液、人細胞等。皮膚和軟組織感染樣本的潛在干擾物應考慮血液、膿液、血漿、常用外用抗菌藥、抗生素等皮膚用藥。血培養樣本的潛在干擾物質應考慮血培養基、樹脂及活性炭等，具體結合培養瓶類型確定。
6.陽性/陰性參考品符合率 陽性參考品的檢測旨在驗證試劑盒檢測范圍內的MRSA/SA均可以在適當的濃度被檢測到，陽性參考品檢測結果應為陽性。陰性參考品旨在評價試劑特異性，陰性參考品檢測結果應為陰性。
7.方法學比對研究 為驗證擬申報產品靶核酸檢測的準確性，應選擇部分臨床樣本將擬申報產品與已上市核酸檢測試劑進行比較研究。所選對比試劑檢測靶基因應與擬申報試劑一致，方法性能可比，且臨床公認質量較好;
對于無已上市核酸檢測試劑的目的基因，可與病毒核酸序列測定方法進行比對。用于核酸序列測定的引物序列應不同于考核試劑中用于檢測目的基因的引物序列。建議對擴增子進行雙向測序。方法學比對研究的具體方式可參考相關的國外或國內有關的指導文件進行，臨床樣本數量及其特性應具有代表性，能夠充分驗證擬申報產品靶核酸檢測的準確性。
8.其他性能研究(如涉及) 如攜帶污染的驗證，使用高陽性樣本和陰性樣本交叉檢測多次運行，考察設備多樣本檢驗是否存在攜帶污染。
(五)陽性判斷值確定資料 對于此類試劑，陽性判斷值即為針對每個目標物能夠獲得理想的臨床靈敏度和臨床特異性的臨界值(Cutoff)，對于熒光探針PCR方法即為Ct值的確定資料。建議采用受試者工作特征(ROC)曲線的方式進行相關研究。申請人應選取適當的足夠數量的臨床樣本進行試驗以確定陽性判斷值。
(六)穩定性研究資料 穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括實時穩定性(有效期)、開瓶穩定性及凍融次數限制等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。
樣本穩定性進行研究，可以在合理的溫度范圍內，每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的效期穩定性。冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。
對于樣本提取后不能立即進行檢測的，應明確核酸儲存條件、儲存時間等內容，同時應提供相應的核酸穩定性研究資料。
試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。
(七)產品風險分析資料 申請人應參考YY/T 0316《醫療器械 風險管理對醫療器械的應用》規定的過程和方法，在產品生命周期內對申報產品可能造成的危害進行判定(可重點參考YY/T 0316的附錄H)，對每一危害處境的風險進行判定和評價，形成風險管理報告，控制這些風險并監視控制的有效性，充分保證產品的安全性和有效性。
該試劑的主要危害大致可包括三個方面，即：生物學和化學危害、操作危害、信息危害。
1.生物學和化學危害 生物學：如細菌、病毒引起的交叉感染、檢測完成后剩余樣本、試劑和廢棄物處理不當引起的交叉感染。
化學：如使用的清潔劑、消毒劑殘留引發的危害。
2.操作危害 不正確的測量：
如未按使用說明書中的要求進行測量，造成的測量失敗、測量誤差過大。
使用未經驗證的不同廠家的分析儀或使用未經正確保養或校準的儀器，造成的測量失敗、測量誤差過大。
在制造商規定的使用環境條件外使用產品，可能造成測量誤差過大。
3.信息危害 如說明書或標簽缺少或不正確，標記的位置不正確，不能被正確的識別，不能清楚易認。
不符合法規及標準規定的產品說明書，包括產品說明書中未對限制充分告知，未對不正確的操作、與其他設備共同使用時易產生的危害進行警告，未正確標示儲存條件、消毒方法、維護信息，未對因長期使用產生功能喪失而可能引發的危害進行警告，未對合理可預見的誤用進行警告等引發的危害。
(八)臨床評價資料 臨床試驗的開展、方案的制定以及報告的撰寫等均應符合相關法規及《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》(國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號)的要求。
1.研究方法 建議采用前瞻性臨床試驗對擬申報產品進行臨床評價，以SA和MRSA鑒定和藥敏檢測臨床參考方法作為對照方法，金黃色葡萄球菌鑒定應結合形態學、凝固酶試驗和生化鑒定、質譜方法等方法，藥敏方法建議使用頭孢西丁紙片法或苯唑西林微量肉湯/瓊脂稀釋法(MIC)，也可以應用相應的全自動鑒定藥敏方法，證明擬上市產品的臨床性能和預期用途。針對不同樣本類型對應的不同預期用途，分別設計臨床試驗進行研究。
2.臨床試驗病例數 臨床試驗樣本量應滿足統計學要求，可采用適當的統計學方法進行估算。本臨床試驗的主要評價指標為擬申報產品相對于臨床參考方法的靈敏度和特異性。
臨床總體樣本量應分別考慮SA和MRSA陽性和陰性樣本量的統計需求，綜合估算。SA和MRSA的臨床試驗陽性樣本例數的估算建議采用單組目標值法，考核試劑的SA鑒定和MRSA藥敏檢測靈敏度目標值建議針對不同樣本類型設置，建議鼻拭子、痰液、皮膚軟組織拭子等直接樣本的目標值不低于90%，血培養樣本目標值不低于95%。通過參數估計(含相應可信區間估計)的方法證明產品針對SA鑒定和MRSA藥敏檢測的靈敏度不低于目標值，可參考如下樣本量公式計算。
n=Z1-α/2P01-P0+Z1-βPT1-PT2PT-P02 公式中，n為樣本量;
Z1-α/2、Z1-β為標準正態分布的分數位，P0為評價指標的目標值，PT為試驗用體外診斷試劑評價指標預期值。
SA和MRSA的陰性樣本量的估算可不采用目標值法，建議根據預實驗獲得的特異度的預期值采用如下公式計算：
n=Z1-α/22P(1-P)Δ2 公式中n為樣本量，Z1-α/2為標準正態分布的分位數，P為評價指標預期值，Δ為P的允許誤差大小，一般取P的95%可信區間寬度的一半，常用的取值為0.05-0.1。
同時總體樣本確定時應考慮到培養鑒定的成功率、其他可能造成樣本脫落的情況以及可能需要納入的干擾等適當增加樣本量。如不同樣本類型適用不同預期用途，針對每一種預期用途臨床試驗總病例數均應分別滿足統計學要求。
3.臨床研究單位的選擇 應選擇不少于3家(含3家)臨床試驗機構，按照相關法規、指導原則的要求開展臨床試驗。臨床試驗機構的選擇應盡量考慮擬申報產品的特點和預期用途，綜合流行病學背景，鑒于不同地區及醫療機構中SA/MRSA流行情況的差異，應選擇不同地區的臨床試驗機構開展臨床試驗，不得選擇同一地區地域相近的醫療機構進行臨床試驗。且臨床試驗機構應具有分子生物學方法檢測的優勢，實驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統的各環節，熟悉評價方案。
4.病例選擇及樣本類型 臨床試驗病例選擇應根據產品聲稱預期用途中使用的樣本類型及適用人群進行選擇，如臨床背景內容中所述，該產品適用不同樣本類型時對應不同的臨床預期用途，采用鼻拭子樣本的試劑用于MRSA院內感染的預防和控制時，應采用醫療機構中的住院病人包括重癥監護病人、手術病人及長期護理病人等病例進行臨床研究;
皮膚及軟組織感染拭子用于結合其他實驗室檢測如微生物培養等輔助診斷MRSA/SA的皮膚和軟組織感染時，應采用臨床皮膚和軟組織感染病例進行臨床研究;
血培養測定為陽性微生物生長并顯示包含由革蘭染色法產生的革陽性球菌(GPC)的樣本用于臨床需進行血培養檢測的患者MRSA/SA感染的輔助診斷時，應采用臨床需進行血培養檢測的患者，且血培養測定為陽性微生物生長并顯示包含由革蘭染色法產生的革蘭陽性球菌的患者作為病例進行臨床研究。同時適用于上述不同樣本類型時，應分別進行相關病例的臨床研究。
申請人在建立病例納入標準時，應綜合考慮到試劑所適用的各類人群的潛在差異，如年齡、性別、病情等。
同時應關注樣本中其他病原體的存在情況、內源和外源干擾因素。
5.倫理學要求 臨床試驗必須符合赫爾辛基宣言的倫理學準則，必須獲得臨床試驗機構倫理委員會的同意。研究者應考慮臨床試驗用樣本的獲得和試驗結果對受試者的風險性，應提交倫理委員會的審查意見。
6.臨床試驗方案 臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等多方面考慮，設計科學合理的臨床研究方案。各臨床研究機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床研究機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。
試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑應一致，以便進行合理的統計學分析。
7.統計學分析 對臨床試驗結果的統計應選擇合適的統計方法，如檢測結果一致性分析、臨床靈敏度、特異度等。常選擇2×2表的形式總結兩種方法的定性檢測結果。在臨床研究方案中應明確統計檢驗假設，即評價考核試劑與參比方法是否等效的標準。靈敏度結果的95%置信區間下限應高于目標值。特異性結果與預期值差異應有明確可接受標準，如差異較大，應有合理的解釋或繼續擴大樣本量。應分別對SA和MRSA的檢測結果進行比較統計和分析。
對于不一致樣本，應在方案中明確是否需進一步復測或確認，并對不一致原因進行分析。
8.質量控制 臨床試驗開始前，建議進行臨床試驗的預試驗，以熟悉并掌握相關試驗方法的操作、儀器、技術性能等，最大限度控制試驗誤差。整個試驗過程都應處于有效的質量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可精密度精密度。
9.臨床試驗總結報告撰寫 根據《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進行詳述。
9.1臨床試驗總體設計及方案描述 9.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。
9.1.2病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數及標準、盲態檢測要求等。
9.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。
9.1.4統計學方法、統計軟件、評價統計結果的標準。
9.2 具體的臨床試驗情況 9.2.1臨床試驗所用體外診斷試劑及儀器的名稱、批號、機型等信息。
9.2.2對各研究單位的病例數、年齡分布情況分布情況進行綜合，建議以列表或圖示方式列出各年齡組的樣本例數。
9.2.3質量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、儀器校準、質控品運行情況。
9.2.4具體試驗過程，樣本收集、樣本保存、樣本檢測、結果處理、結果不一致樣本的確認等。
9.3統計學分析 9.3.1數據預處理、差異數據的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數據統計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改;
9.3.2結果的一致性分析 計算陽性符合率、陰性符合率、總體符合率，采用適當的統計學方法，如四格表卡方檢驗或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結果的一致性。
9.4討論和結論 對總體結果進行總結性描述并簡要分析試驗結果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結論。
9.5其他 臨床試驗中如涉及核酸序列測定方法，應在臨床研究報告中對選用的測序方法做詳細介紹，并提供以下關于測序試驗的詳細信息及資料。
9.5.1測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關信息。
9.5.2測序方法所用引物相關信息，如基因區段選擇，分子量、純度、功能性試驗等資料。
9.5.3對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與擬申報產品的相關性能進行適當比對分析。
9.5.4測序方法應建立合理的陽性質控品和陰性質控品對臨床樣本的檢測結果進行質量控制。
9.5.5提交有代表性的樣本測序圖譜及結果分析資料。
(九)產品技術要求 申請人應當在原材料質量和生產工藝穩定的前提下，根據申請人產品研制、前期臨床評價等結果，依據國家標準、行業標準及有關文獻，按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》(國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號)的有關要求，編寫產品技術要求。
該試劑的產品性能指標應主要包括：物理性狀、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。性能指標應依據分析性能評估試驗結果確定，檢驗方法應明確具體操作方法和使用的樣本及參考品情況。
該產品為第三類體外診斷試劑，申請人應按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》的要求，以附錄形式明確主要原材料、生產工藝及半成品要求，附錄的編制應符合相關編寫規范的要求。
(十)產品檢驗報告 應提供該產品符合產品技術要求的，在具有相應醫療器械檢驗資質和承檢范圍的醫療器械檢驗機構進行的產品檢驗報告;
應提供連續3個生產批次樣品的檢驗合格報告。
(十一)產品說明書 說明書承載了產品預期用途、標本采集及處理、檢驗方法、檢驗結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據，因此，產品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》(國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號)的要求，進口體外診斷試劑的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書中相關技術內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進行標注，并單獨列明文獻的相關信息。
結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌鑒別和檢測的體外診斷試劑說明書的重點內容進行詳細說明，以指導注冊申報人員更合理地完成說明書編制。
1.【預期用途】 1.1試劑盒用于定性檢測人鼻拭子、痰液、皮膚及軟組織感染拭子、血培養測定為陽性微生物生長并顯示包含由革蘭染色法產生的革蘭陽性球菌的樣品等樣本的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌，適用樣本類型應結合實際的臨床研究完成情況進行確認。
1.2明確試劑不同樣本類型的臨床意義，如鼻拭子樣本用于醫療機構對住院病人包括重癥監護病人、手術病人及長期護理病人等MRSA院內感染的預防和控制;
皮膚及軟組織感染拭子用于結合其他實驗室檢測如微生物培養等輔助診斷MRSA/SA的皮膚和軟組織感染;
血培養測定為陽性微生物生長并顯示包含由革蘭染色法產生的革蘭陽性球菌的樣本用于臨床需進行血培養檢測的患者MRSA/SA感染的輔助診斷等。
1.3SA和MRSA流行特征介紹。
1.4簡單介紹待測目標的特征，如待測靶基因特征及與SA和MRSA的關系等。
2.【檢驗原理】 詳細說明試劑盒技術原理，即核酸分離/純化方法、原理。說明檢測的靶基因座位、序列長度等;
介紹引物及探針設計、不同樣品反應體系(管)組合、對照品(質控品)設置及熒光信號標記等。如添加了相關的防污染組分(如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等)，也應對其作用機理作適當介紹。
3.【主要組成成分】 詳細說明試劑盒內各組分的名稱、數量、成分、濃度等信息，如含有生物源性物質，應說明其生物學來源、活性及其他特性;
說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。
試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，應列出相關試劑的生產企業、產品名稱、貨號以及醫療器械注冊證號/備案號(如有)等詳細信息。當試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分時，應在此注明經驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的如上信息。
4.【儲存條件及有效期】 試劑盒的效期穩定性、開瓶穩定性、復溶穩定性、凍融次數要求等，應與相應的穩定性研究結論一致。
5.【適用儀器】 所有適用的儀器型號，提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。
6.【樣本要求】 明確適用的樣本類型。并詳細描述樣本采集及預處理要求、運輸要求、保存條件及期限等。特別是樣本采集所需設備及保存液，需特別明確供應商、貨號及注冊證號(如有)。有關描述均應建立在相關性能評價及穩定性研究的基礎上。
樣本的取材及處理方式等若有通用的技術規范或指南，則應遵循，并在此處引用。
7.【檢驗方法】 詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：
7.1試劑配制方法、注意事項。
7.2核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項。對照品(質控品)參與樣本核酸的平行提取的要求等。
7.3擴增反應前準備：各組分加樣體積、順序、相關注意事項等。
7.4 PCR各階段的溫度、時間設置、循環數設置及相關注意事項。
7.5儀器設置：特殊參數，待測基因、內標的熒光通道選擇等。
7.6質量控制：說明對照品(質控品)的檢測要求。
8.【陽性判斷值】 簡要總結陽性判斷值研究方法及結論。明確說明樣本的陽性判斷值。
9.【檢驗結果的解釋】 說明對照品、內標的正確結果要求，結合對照品(質控品)以及樣本管中靶基因和內標的檢測結果，對所有可能出現的結果組合及相應的解釋進行詳述。檢驗結果的解釋應以陽性判斷值的研究結論為依據。
10.【檢驗方法的局限性】 應至少包括如下描述：
10.1本試劑檢測結果應結合患者臨床癥狀及其他相關醫學檢查結果進行綜合分析，不得單獨作為患者管理的依據。
10.2基因檢測結果僅能覆蓋耐藥機制為相應基因(如mecA基因和或mecC)的耐藥結果，但是小部分MRSA不攜帶mecA和/或mecC基因，存在其它耐藥機制，可能出現漏檢。
10.3不合理的樣本采集、轉運及處理以及不當的實驗操作和實驗環境均有可能導致假陰性或假陽性結果。
11.【產品性能指標】 詳述分析性能評估的試驗結果并簡要描述臨床試驗的基本信息、試驗方法和結論。
12.【注意事項】 應至少包括以下內容：
12.1如該產品含有人源或動物源性物質，應給出生物安全性的警告。
12.2臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》(衛辦醫政發〔2010〕194號或現行有效版本)等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。
12.3強調產品性能僅針對聲稱的適用樣本類型及【樣本要求】項下說明的樣本采集和處理方法(包括樣本采集液等)進行了驗證，其他樣本類型或樣本采集、處理方法不能保證產品性能。
12.4強調實驗操作人員應接受過基因擴增或分子生物學方法檢測的專業培訓，具備相關的實驗操作資格，實驗室應具備合理的生物安全防備設施及防護程序。
四、編寫單位 國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心。
第五篇：人感染豬Ⅱ型鏈球菌病防控工作匯報
月29日，區委、區政府動員部署防控人感染豬Ⅱ型鏈球菌病工作后，龍蟠鎮黨委、政府迅速行動，及時成立了以鎮長為組長、分管農業的副鎮長為副組長的領導小組，迅速完善六項工作措施，環環緊扣地抓好了人感染豬Ⅱ型鏈球菌病防控工作。
一、強化宣傳引導，提高群眾防范意識。7月30日，龍蟠鎮召開村三職干部會、駐村干部會和屠戶專題宣傳會，累計印發宣傳資料5500份，張貼公告150份，鎮村廣播宣傳80余次，對豬Ⅱ型鏈球菌病病理特征、傳播渠道、防范措施進行宣傳，要求各地采取村包社、社包戶的辦法嚴密防范，確保鎮不漏村、村不漏戶、戶不漏豬，一旦發現病死豬現象，層層迅速向鎮政府報告，由鎮政府報告區畜牧局后對死豬采取“四不一處理”(不宰殺、不食用、不銷售、不轉用，進行無害化處理)。
二、建立統防統治機制，全民動手防疫病。龍蟠鎮把消毒殺菌作為防控疫情的重點工作來抓，先后購買航天消毒液60瓶，投入8500元用于消毒防疫工作。一是以村為單位聘請噴霧員，8月1日前對養豬戶和大型養豬場實施統防統治，全面消毒一次;二是實行業主負責制，8月1日前對生豬販賣市場、屠宰市場、豬肉市場全面消毒一次。
三、建立健全生豬檔案，全面掌控豬動向。龍蟠鎮組織駐村干部和村社干部一道對全鎮圈存生豬進行普查(目前全鎮養豬戶共有4061戶，圈存生豬6351頭：其中50斤以下的小豬2032頭，50到130斤的架子豬3012頭，130斤以上的大豬1206頭，種豬101頭)，并對每頭豬都建立戶口檔案，全面實行“增豬上戶、減豬下戶”制度，屠戶何時何地收購生豬、何時何地銷售豬肉都要登記造冊，確保能有效掌控全鎮生豬動向。
四、屠宰市場“三簽字”，凈化市場保質量。龍蟠鎮共有3個定點屠宰場，為凈化屠宰市場，該鎮除由工商所、獸防站依法抓好執法檢疫外，還要求欲屠宰生豬須經養豬戶、屠戶、市場管理員(協稅員)三方同時簽字后方可屠宰，消除了屠宰病死豬及私屠亂宰現象。
五、銷售末端“三公開”，群眾吃上放心肉。凡是上市豬肉，全部實行“三公開”，“掛牌銷售”，即：在賣肉攤點公開養豬戶、屠戶、市場管理員姓名。鼓勵群眾舉報違規銷售豬肉現象，一經查實給予舉報者50元獎勵，并對違規銷售豬肉攤點的豬肉全部進行無害化處理;對發現銷售未經檢疫二道邊口肉的個體戶，除銷毀全部豬肉外，還將處以500—2000元的罰款。
六、相關部門齊配合，開展專項整治行動。為了落實各項政策，徹底阻斷疫源。龍蟠鎮邀請區畜牧局、衛生局、工商局、公安分局、商務局、交通局、安監局、防疫站等部門利用逢場天派人到龍蟠鎮開展執法專項檢查。畜牧部門抓好生豬疫病防治，實現生豬防治率達100%;衛生防疫部門做好人的疫病調查及餐館衛生防疫情況檢查;工商部門加強市場監管，保證豬肉銷售“三公開”，杜絕病死豬肉進入市場;商務部門嚴格定點屠宰管理，杜絕私屠亂宰，凡違反者處以500—2000元罰款;安監、交通、公安部門對過往客貨車全面檢查，嚴禁運送未檢疫豬肉或病死豬肉，一經發現，取消客貨車司機營運資格。