豬瘟 (Swine Fever) 又名豬霍亂 (Hog Cholera , HC) , 它是由豬瘟病毒 (Classical Swine Fever Virus, CSFV) 引起的一種急性﹑高度接觸性傳染病, 歐洲人稱之為古典豬瘟。家豬和野豬均是CSFV的自然宿主。本病根據其臨床癥狀, 可劃分為典型性豬瘟和非典型性豬瘟。目前, 由于CSFV毒力強弱不一, 免疫程序不合理, 疫苗劑量不夠等因素致使典型性豬瘟趨少, 而非典型性豬瘟逐漸增多。尋求有效的豬瘟控制措施成了當前獸醫工作者的當務之急。由于非典型性豬瘟的臨床癥狀及其病理變化不及典型性豬瘟病例明顯, 導致臨床診斷越來越困難。目前, 本病的診斷主要以實驗室診斷為主。
標準的實驗室診斷程序是防控非典型性豬瘟的重要手段之一, 實驗室診斷方法主要包括病毒及病毒抗原的檢測和血清學檢測兩個方面。此診斷報告在實驗室診斷中采用了豬瘟直接免疫熒光抗體試驗和夾心ELISA的方法。
1 發病情況
2007年9月, 蘭州市郊某中型豬場發生以主要感染1月齡以內仔豬的病例, 并在豬群中迅速傳播。仔豬感染率為37.5%, 病死率達100%。發病仔豬達5~7頭/窩, 多數發病仔豬呈急性經過 (一周之內) , 最終死亡。使用抗生素等藥物或其它治療方法, 均不見效果。
2 流行病學調查
該豬場主要以圈養式為主, 采取自繁自養的養殖方式。豬場圈舍設計、布局及衛生條件符合國家規定標準。場內每周消毒一次, 保溫較好, 但通風條件較差。豬場每年在春秋來臨之季分別對豬群進行豬瘟、豬肺疫、口蹄疫等疫苗程序免疫。在發現此病后, 工作人員對豬場病豬、疑似感染豬進行隔離, 且每天進行嚴格消毒, 對未感染仔豬和母豬進行緊急疫苗接種 (豬瘟﹑豬肺疫﹑口蹄疫和豬呼吸與繁殖障礙疫苗) 和抗生素治療。
3 臨床癥狀
本次發病仔豬病程大致可劃分為三期:早期表現為食欲略有下降, 身體消瘦、被毛粗亂, 精神萎頓;中期以上癥狀有所恢復, 發病仔豬腹下、鼻端、耳根和四肢內側等部位出現針尖大小的出血點, 體溫略有升高。兩眼或單眼有結膜炎, 有多量黏液—膿性分泌物, 嚴重時眼瞼完全被封。食欲正常, 沒有便秘或腹瀉等癥狀;病程后期 (3~5 d后) 原先出現紅疹區的部位大面積起皮, 鼻端有潰爛現象, 四肢皮膚發紺, 耳朵、尾巴發生干性壞疽, 體溫先是略有升高, 而后正常;表現為精神不振, 呆滯, 食欲減少, 進而停食, 突然死亡。母豬不表現明顯的臨床癥狀。
4 剖檢變化
病死仔豬尸體剖檢可見下頜淋巴結、腮下淋巴結、支氣管淋巴結和腸系膜淋巴結周邊都有肉眼幾乎不可見的針尖大小出血點, 切面呈大理石樣。扁桃體腫脹;肺臟、脾臟、胰臟、心房有不同程度的出血點;腎臟蒼白, 也有針頭大小出血點;膽汁為黃色, 呈糊狀;小腸及其漿膜上有充血、出血;小腸內容物比正常略有干燥。仔豬肋骨肋軟骨交界出現一條白線, 附近有出血帶。
5 實驗室診斷
5.1 豬瘟直接免疫熒光抗體試驗
剖檢病死仔豬, 取其扁桃體、腎臟、淋巴結等組織。速凍1 min后, 進行冰凍切片, 厚度為6 μm, 切片展貼于潔凈載玻片上;經丙酮固定15 min后, 用PBS緩沖液漂洗, 自然風干;用豬瘟、豬細小病毒、豬病毒性腹瀉的三價熒光抗體 (購自中國獸藥檢察所) 滴加于切片表面, 于37℃下作用0.5 h后, 輕漂洗, 自然干燥;封固蓋片, 鏡檢。于熒光顯微鏡視野中, 可見組織上皮細胞漿內呈現黃色、綠色或黃綠色, 細胞核不著色, 細胞輪廓分明, 為豬瘟病毒感染陽性。
5.2 夾心ELISA
5.2.1 材料與方法:
豬瘟抗原診斷試劑盒 (購于美國IDEXX公司) ;已包被96孔微量滴定板;Sunrise酶標儀;Varian Cary50紫外分光光度計;超速離心機等;隨機抽取5頭患病仔豬的肝、脾、腎、淋巴結和血液;夾心ELISA診斷方法操作步驟見試劑盒說明書。
5.2.2 原理﹑計算及判定依據:
能與豬瘟病毒結合的多克隆血清 (包被反應板) 加待檢樣品, 充分結合后按先后順序分別加豬瘟病毒特異性單抗、酶標抗體和底物, 最后觀察顏色變化。在單一波長450 nm或雙波長450 nm和620 nm處用Sunrise酶標儀測定各反應孔的OD值并計算結果。
計算:Corrected OD = Sample OD- Neg.control OD。
判定依據:為了確保試驗的有效性, 陽性對照的平均OD值要大于0.500, 陰性對照的平均OD值要低于陽性對照的平均OD值的20%。
樣品的修正吸光光度值大于0.300, 則為陽性;樣品的修正吸光光度值小于0.200, 則為陰性;樣品的修正吸光光度值介于0.200和0.300之間, 判定為可疑。
5.2.3 夾心ELISA診斷結果:
根據夾心ELISA的操作步驟, 得出OD值, 見表1。
實驗有效性判定。陽性對照OD值0.803 > 0.5;陰性對照OD值0.091 < 0.803×20﹪ = 0.160 6。
故該試驗有效。
判定樣品修正值見表2。
由以上結果得出所檢測病豬的肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結、血液樣品均為陽性, 即其肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結、血液中豬瘟抗原陽性。
故實驗室確診此次病患流行為由CSFV引起的非典型性豬瘟。
6 討論
CSF是豬的一種高度接觸性傳染病, 該傳染病可分為急性、亞急性、慢性、非典型性和不明顯型。從20世紀80年代以后, 臨床癥狀不典型且病程變長的非典型性豬瘟成為該病的主要發生形式, 持續感染普遍存在, 疫苗的預防效果明顯下降, 給本病的防制造成了很大的困難和障礙。一般認為是豬感染了CSFV變異毒株后發生非典型性豬瘟, 這種變異毒株是在免疫壓力下出現的毒力變異毒株。
6.1 病因
豬瘟病毒只有毒力強弱之分。當CSFV低毒株感染妊娠母豬時, 起初常不被發覺, 但病毒可侵襲子宮中的胎兒, 分娩時排出大量CSFV。在此次病例中, 雖沒有產死胎和弱仔的現象。但據報道這種先天性感染的仔豬雖出生時正常, 保持健康, 幾個月后會發病, 并且在此期間可作為病毒散布的持續感染來源而很難被辨認出來。
由于CSFV的某些毒株毒力性狀不穩定, 通過豬體一代或多代后可使毒力增強, 所以很有可能使仔豬發病提前, 從而使發病期提前在一個月內。
針對本次病情, 調查得知, 該場場主所選用的豬瘟兔化弱毒疫苗購自于當地獸醫防疫站。該苗雖然具有高度安全性和優良的免疫原性, 但由于以往評價疫苗免疫效果及制定免疫標準通常是以防止臨床感染為標準。應用這一標準時, 常有部分豬免疫后, 抗體水平不能防止亞臨床感染。尤其是亞臨床感染的妊娠母豬, 雖無明顯癥狀, 但卻是CSFV的主要宿主, 不僅可以通過垂直傳播傳給仔豬, 并且可以通過公種豬對其它母豬進行水平傳播, 從而將該病蔓延至整個豬場。
另外, 筆者認為, 養殖場戶的免疫程序不合理導致了疫苗免疫合格率不高。 場主于仔豬20日齡以后才開始接種豬瘟疫苗, 而母豬乳中的母源抗體在產后15 d已開始下降, 期間出現一個豬瘟免疫空白期, 這對一個被CSFV污染的豬場是很危險的。
仔豬出生后注射了一系列的保健針、防疫針 (豬瘟﹑豬肺疫﹑口蹄疫和豬呼吸與繁殖障礙疫苗) , 從而使得仔豬應激太頻繁, 很可能減弱仔豬產生抗體的機能, 降低預防接種的效果。
據場主介紹, 由于當時注射疫苗針頭不足, 某些豬共同使用一個針頭。該操作很容易將CSFV帶入其它健康豬體內, 造成此病的快速蔓延。
在發生此病后, 場主采用了緊急接種和抗生素治療相結合的策略。然而, 一般情況下, 使用弱毒疫苗前后一段時間, 不應使用抗菌藥物。研究證明, 鏈霉素、新霉素、卡那霉素、四環素、糖皮質激素等藥物或對動物體內抗體的形成有抑制作用, 或對T、B 淋巴細胞的轉化有明顯抑制作用, 從而影響免疫效果。因此, 在免疫前后, 不可使用抗生素藥物。
發病豬場位于市郊, 但場舍的通風設施不佳。其次, 飼料營養的合理調配也至關重要。該養豬場的飼料是從外地買回原料后自行配制, 飼草較單一, 應注意調劑的使用, 多加入青綠多汁飼料和骨粉等, 增加胡蘿卜素和鈣磷物質的含量, 以滿足豬只的營養需要。
6.2 實驗室診斷
豬瘟熒光抗體染色技術檢測細胞內的病毒。它具有檢測時間短、操作簡便、結果直觀、準確率高等特點。目前, 許多國家和地區已將該法作為執行消滅豬瘟規劃的法定診斷方法, 也是我國實驗室診斷豬瘟病毒最常用的方法之一。它主要用于檢測病毒抗原, 也可檢測抗體。該技術的關鍵是制備高效價的高免疫血清, 從中提取IgG, 進行免疫熒光標記。
夾心ELISA具有靈敏性高、特異性強的優點, 目前已成為我國診斷CSFV最常用的診斷方法。然而由于該操作時間較長 (2 d) , 有時可能會延誤豬場對該病的防治。目前, IDEXX公司生產的Herdchek豬瘟抗體ELISA試劑盒有快速和過夜兩種模式, 快速模式3 h內出結果, 充分彌補了中和試驗的不足之處。
6.3 防治措施
防治本病需堅持“預防為主”的主導思想。加強飼養管理, 健全防疫衛生制度, 嚴格執行衛生預防措施, 定期消毒, 嚴防病原傳入;購買質量可靠的疫苗, 防止疫苗失效;防疫注射做到頭頭免疫。針對此次病例的特點, 筆者提幾點綜合防止措施。
凈化豬場, 開展豬瘟的抗體檢測, 及時檢出低抗體的病豬, 淘汰隱性感染的母豬。通過免疫檢測, 還能為制訂合理的免疫程序提供可靠的依據。目前檢測豬瘟抗體的方法很多, 常用的有ELISA 法和間接血凝法等。保證空懷母豬母源抗體不低于1∶64, 分娩母豬不低于1∶32。
規范免疫接種操作規程, 建立合理的免疫程序, 制定免疫程序的關鍵是如何排除母源抗體干擾, 確定合適的首免日齡。一般認為母源抗體效價降到1∶4~8 時是豬瘟疫苗首免的最佳時期。同時加大劑量亦可中和一定的母源抗體?？晒﹨⒖嫉拿庖邉┝繛?種豬4~5 頭份;仔豬2~3 頭份;仔豬母源抗體在1∶32 以上時, 以4頭份疫苗劑量的免疫效果最佳。
其次, 豬場應根據具體情況建立自己的免疫程序。一般根據抗體的水平進行免疫注射。不能測抗體則可參考以下免疫方法:仔豬在20~25 日齡用豬瘟活苗進行首免, 每頭仔豬接種2頭份;60~70日齡用豬瘟活苗進行二免, 每頭接種3~4頭份;種豬在200~220日齡用豬瘟活苗進行三免, 接種4~6頭份。種用成年公豬每年補防2次, 每次接種4~6頭份。經產母豬在斷奶時或配種前補防1次。
發現可疑疫情, 立即采集病料, 送至有關單位作抗體和抗原的檢測。測定抗體水平是為本場建立合理的免疫程序提供科學的依據, 而測定抗原才可以發現病原, 確診疾病。一旦確診存在非典型豬瘟, 應立即對易感豬進行檢疫, 并分為三種類型:一是體溫高達41℃以上, 呼吸極度困難 (數種病并發感染) 為重病豬, 治療無望應立即淘汰。二是體溫略高, 約40℃左右, 全身體況尚好, 可用大劑量豬瘟活疫苗 (10~15 頭份) 1次注射。繼而用抗生素或磺胺類藥物及維生素C肌肉注射, 以防繼發細菌感染。三是體質健壯健康良好的仔豬為假定健康豬, 立即用5 頭份豬瘟活疫苗補防1次。
非典型豬瘟發生期間哺乳期內的仔豬盡量避免注射。同時要注意加強飼養管理, 搞好欄舍衛生, 仔豬進欄用豬瘟疫苗4頭份肌注免疫。