2006年, 日本Takahashi[1]在既往實驗和理論的基礎上, 從24個候選基因中篩選出4個胚胎干細胞特異性轉錄因子 (Oct4、Sox2、cMyc、Klf4) , 并將其導入已分化的小鼠皮膚成纖維細胞, 成功地將其重編程為類似于胚胎干細胞的多能干細胞, 稱之為“誘導性多能干細胞”即 (induced pluripotent stem cells, iPSC) 。iPSC是通過基因轉染技術將胚胎特異性轉錄因子 (如, Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4) 導入動物或人的體細胞, 使其直接重構成為胚胎干細胞樣的多潛能細胞。2006年以來, 國外有多個實驗室通過在人類高度分化細胞中表達外源性干細胞因子而誘導獲得了與胚胎干細胞特性十分近似的誘導多能干細胞 (iPS細胞) 系。本實驗室通過實驗分別構建Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因慢病毒表達載體, 為這4個基因在將體細胞誘導為iPS提供前提條件。
1 臨床資料
質粒和細胞:慢病毒表達載體穿梭質粒pGC-FU Vector、慢病毒結構質粒p Helper 1.0、慢病毒包膜蛋白質粒p Helper2.0、Oct4基因表達質粒、Sox2基因表達質粒、c-Myc基因表達質粒、Klf4基因表達質粒購自上海吉凱基因化學技術有限公司;293T細胞購自Invitrogen公司;試劑:質粒抽提試劑盒購自Qiagen公司;Lipofectamine200購自Invitrogen公司;胎牛血清、胰酶和DMEM培養基為Gibco公司的產品, M-MLV逆轉錄酶和dNTP購自PROMEGA公司, OligodT購自上海生工, Marker購自Fermentas公司;AgeI酶購自NEB公司。
2 方法
2.1 引物設計及合成
根據pGC-FU Vector要求在引物中加入AgeI酶切位點。
M:Marker 5 kb, 3 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1 Kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp
ACCGGT于PCR擴增Oct4基因F5-CGGGTACCGGTCGCCA CCATGGCGGGACACCTGGC-3R5-CCGGAATTCTCACTTGT CATCGTCATCCTTGTAGTCGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3, PCR產物大小:1134bp;同理以下是其余3個基因擴增引物Sox2基因F5-CGGGTACCGGTCGCCACCATGTACAACATGATG GAGACGG-3R5-CCGGAATTCTCACTTGTCATCGTCATCC TTGTAGTCCATGTGTGAGAGGGGCAG-3, PCR產物大小:1005bp;c-Myc, F5-CGGGTACCGGTCGCCACCATGGATTTTTTT CGGGTAGTGGAAAACCAGCAGCCTCCCGCGACGA-3R5-C CGGAATTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCCGCAC AAGAGTTCCGTAGC-3, PCR產物大小:1416bp;Klf4 F 5-CG GGTACCGGTCGCCACCATGGCTGTCAGCGACGC-3R5-CCG GAATTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCAAAATGC CTCTTCATGTGTAA-3, PCR產物大小:1464bp。PCR鑒定目的基因重組連接的陽性克隆菌落, 其中Oct4 F5-CCTGGTGCCG TGAAGCTG-3R5-AGCGTAAAAGGAGCAACATAG-3, PC R產物大小798bp;Sox2 F5-GAGCGCCCTGCAGTACAAC-3R5-AGCGTAAAAGGAGCAACATAG-3, PCR產物大小467Bp;c-Myc, F5-CCACACATCAGCACAACTACG-3R5-AGCGTA AAAGGAGCAACATAG-3, PCR產物大小531bp;Klf4 F5-CA ATTACCCATCCTTCCTGC-3R5-AGCGTAAAAGGAGCAAC ATAG-3, PCR產物大小521bp。上述引物設計與合成均由上海吉凱基因化學技術有限公司完成。
2.2 重組慢病毒載體質粒的構建
采用PCR技術分別從4個含目的基因表達質粒中擴增目的基因, 用AgeI酶分別酶切載體pGC—FU Vector和上述PCR產物, 瓊脂糖電泳分離純化。將酶切回收載體DNA、酶切回收的PCR產物、In-Fusion交換酶及buffer與ddH20加入反應體系, 于23℃反應15min, 再于42℃反應15min制備克隆交換液, 轉化DH5a。PCR鑒定細菌陽性克隆, 分別命名為p GC-FU-Oct4、p GC-FU-Sox2、pGC-FU-c-myc、pGC-FU-Klf4送往上海吉凱基因化學技術公司測序。
2.3 慢病毒包裝
制備的各DNA溶液 (pGC-FU-Oct4 20μg, pHelper 1.0載體15μg, pHelper 2.0載體10μg) , 與相應體積的Opti-MEM混合。取100μL Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2.4mL Opti-MEM混合。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進行混合以形成pGC-FU-Oct4 DNA-Lipofectamine 2000復合物。同樣按照上述方法制備pGC-FU-Sox2的DNA-Lipofectamine 2000復合物、pGC-FU-c-Myc的DNA-Lipofectamine 2000復合物、pGC-FU-Klf4的DNA-Lipofectamine 2000復合物。DNA-Lipofectamine 2000混合, 室溫下溫育20min, 混合液轉移至293T細胞的培養液中, 于37℃, 5%CO2細胞培養箱中培養。培養8h后倒去含有轉染混和物的培養基, 加入含10%血清的細胞培養基25mL, 于37℃、5%CO2培養箱內繼續培養48h。收集293T細胞上清液, 4℃, 4000×g離心10min, 以0.45μm濾器過上清液于40m L超速離心管中。于4℃, 25 000r/min, 離心20min, 冰PBS液重旋病毒沉淀, 于4℃溶解過夜。以10μL每管分裝病毒液置于-80℃冰箱中保存。
2.4 慢病毒滴度測定
慢病毒液按10倍梯度稀釋為5個濃度后, 分別感染293T細胞, 細胞培養于含有5ug/mL稻瘟菌素 (Blastieidin, BSD) 的DMEM培養液, 約2周左右去除培養液, PBS漂洗后, 結晶紫溶液進行染色, 最后在倒置顯微鏡下計數細胞克隆數。
3 結果
3.1 4個目的基因克隆PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果 (圖1) , 與設計的克隆片斷大小一致。
3.2 慢病毒轉移質粒的構建及鑒定結果
pGC-FU-Oct4重組質粒陽性克隆PCR產物瓊脂糖電泳圖 (2A) , PCR片段大小為7 9 8 Bp, 測序結果與Ge n eb a n k中正常NM_002701.4序列一致;pGC-FU-Sox2重組質粒陽性克隆PCR產物瓊脂糖電泳圖 (2B) , PCR片段大小為467Bp, 測序結果與Genebank中正常NM_003106.2序列一致;pGC-FU-c-Myc重組質粒陽性克隆PCR產物瓊脂糖電泳圖 (2C) , PCR片段大小為531Bp, 測序結果與Genebank中正常NM_002467.3序列一致;pGC-FU-Klf4重組質粒陽性克隆PCR產物瓊脂糖電泳圖 (2D) , PCR片段大小為521Bp, 測序結果與Genebank中正常NM_004235.4序列一致。
3.3 重組慢病毒的包裝及滴度測定
將獲得的病毒液梯度稀釋后接種于293T, 經Blastieidin篩選, 約2周左右各轉染組均已長出大小不等的細胞克隆, 而對照組則無克隆形成。在倒置顯微鏡下計數細胞克隆, 并計算出所獲重組慢病毒的最終滴度。Oct4基因重組慢病毒、Sox2基因重組慢病毒、c-Myc基因重組慢病毒的滴度均為1×109TU/mL, Klf4基因重組慢病毒的滴度為1.9×109TU/mL。
4 討論
胚胎干細胞被譽為“萬能細胞”, 但一直以來, 獲取人體胚胎干細胞必須摧毀胚胎, 這一點頗受非議。iPSC不僅在細胞形態、生長特性、干細胞標志物表達等方面與胚胎干細胞非常相似, 而且在DNA甲基化方式、基因表達譜、染色質狀態、形成嵌合體動物等方面也與胚胎干細胞幾乎完全相同。iPSC的研究, 回避了長期以來圍繞人類胚胎使用問題的政治和倫理爭論, 并為新藥篩選, 藥物毒理研究和再生醫學等領域提供了廣闊的研究和應用前景。
這4個基因, 按其功能不同分為胚胎干細胞特異轉錄因子Oct4、Sox2, 腫瘤上調基因c-Myc、Klf4。Yamanaka等[1]認為Oct4、Sox2是維持細胞多能性必需的轉錄因子, c-Myc可以激活下游基因, Klf4則通過抑制P53表達來激活NANOG和其它胚胎干細胞特異性因子表達, 從而提高轉化率。Takahashi研究小組[2]去除c-Myc轉錄因子, 利用慢病毒載體分別攜帶Oct4、Sox2、Klf4 3個轉錄因子轉染小鼠胚胎成纖維細胞, 同樣也獲得iPSC, 但此方法的誘導效率約低于4個轉錄因子共同作用10倍;Huangfu等[3]借助助抑制組蛋白去乙?；富钚缘男?種轉錄因子轉染人成纖維細胞, 也成功獲得ips, 誘導率明顯低于3個因子共同作用;Vittorio等[4]用反轉錄病毒載體只攜帶Oct4轉錄因子轉染小鼠神經干細胞獲得iPSC, 誘導成功率為0.014%, 明顯低于2個因子轉染效率, 由此可見這個4個基因對于iPSC的最終形成都起著重要的作用。
本研究所采用的慢病毒載體是近年來出現的一種新的基因轉移工具, 在多項研究中表現出具有轉染分裂期和非分裂期細胞、容載外源目的基因片斷大、能夠將目的基因整合至靶細胞的染色體在體內長期表達、免疫反應小等獨特優點[5]。此外, 研究人員還采用了腺病毒載體法、質粒載體法等方法進行iPSC誘導。Stadffeld等[6]使用腺病毒為載體通過反復轉染小鼠肝實質細胞, 誘導產生小鼠iPSC, 對其進行PCR和Southern雜交檢測, 沒有發現腺病毒的整合。但是這種方法重編程的效率卻比逆轉錄病毒轉染要低得多。對于這種低效率, 一種可能的解釋是使用腺病毒載體本身使用壽命較短, 不能維系一定的感染力, 轉染細胞只能維持3～8d外源基因的表達, 在小鼠成纖維細胞中, 轉基因的表達至少需要8d才能產生iPSCs。Okita等[7]建立包含Oct4、Sox2、Klf4的多順子質粒載體 (polycistroni vector) 和包含c-Myc的質粒載體將小鼠胚胎成纖維細胞誘導為iPSC, 但其誘導率卻更低, 說明病毒基因的整合對iPSC克隆形成率有影響。
由于慢病毒載體源于Ⅰ型人免疫缺陷病毒 (HIV-1) 為保證其作為載體的安全性, 我們采用三質粒包裝系統, 包括轉移質粒、包裝質粒及殼蛋白質粒。慢病毒三質粒系統各質粒單獨存在時既不能形成病毒顆粒, 也不具備轉導能力[8]。轉移質粒將HIV3ˊ端LTR中的U3部分切短, 使之喪失啟動病毒復制的功能, 同時插入CMV啟動子, 成為復制缺陷型病毒載體;包裝質粒去除了HIV包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列;殼蛋白質粒用單純皰疹病毒來源的VSVG基因提供病毒包裝所需要的衣殼蛋白, 大大提高了其安全性, 同時包膜的假構型慢病毒載體擴大了載體的靶細胞嗜性范圍, 而且增加了載體的穩定性, 允許通過高速離心對載體進行濃縮, 提高了滴度。病毒的滴度是進行后續實驗研究的重要條件, 為了提高慢病毒滴度, 本實驗采用共轉染包裝法, 這種方法[9]與傳統方法 (即先將293FT細胞種植于培養板上, 再用DNA一脂質體復合物轉染) 相比, 可提高病毒產量3～4倍, 與傳統的脂質體2000轉染方法的主要區別是:首先制備DNA-脂質體2000復合物, 然后將其加入含生長培養基的板上, 最后加入293FT細胞, 讓細胞轉染復合物與充分接觸, 孵育過夜。結果顯示提取含目的基因病毒滴度都較高, 可以達到滿足后續實驗的要求。本研究旨在構建慢病毒載體轉載4個目的基因, 通過運用基因重組、3質粒表達系統包括包裝質粒、包膜蛋白質粒和轉移質粒共轉293T細胞包裝出高滴度的LV-Oct4、LV-Sox2、LV-c-Myc、LV-Klf4為下一步實驗奠定了基礎。
摘要：目的 構建Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因慢病毒表達載體, 為誘導性多能干細胞研究奠定基礎。方法 將Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因利用Infusion技術重組構建慢病毒載體穿梭質粒pGC-FU-Oct4、pGC-FU-Sox2、pGC-FU-c-Myc、pGC-FU-Klf4, 經PCR和測序后與與結構質粒pHelper1.0和包膜質粒pHelper2.0在脂質體Lipofectamine2000介導下共轉染293T細胞包裝生產慢病毒, 濃縮純化后檢測滴度。結果 PCR擴增和測序結果證實成功構建Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4的慢病毒載體并包裝慢病毒, 檢測Oct4基因重組慢病毒、Sox2基因重組慢病毒、c-Myc基因重組慢病毒的滴度均為1×109TU/mL, Klf4基因重組慢病毒的滴度為1.9×109TU/mL。結論 成功建立重組慢病毒載體的三質粒包裝細胞系統。
關鍵詞：Oct4,Sox2,c-Myc,Klf4,慢病毒載體
參考文獻
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